大肠癌发生中甲基化敏感microRNA的研究

非编码小RNA（包括microRNA）介导的改变属于表观遗传学范畴，近期的研究表明，肿瘤发生中伴随miRNA谱表达异常，其调节机制可能与甲基化调控相关,且部分miRNA可能靶定甲基化转移酶。本项目通过高通量芯片筛选、亚硫酸盐修饰后测序、定量PCR等方法筛选和验证大肠癌甲基化敏感的miRNA；并利用荧光素酶报告基因检测试验和Western blot等手段验证软件预测的靶基因。同时，探究miRNAs表观遗传学谱成为结直肠癌诊断和预后判断的分子标志的可能性。另一方面，通过软件预测并验证甲基化敏感miRNA的靶基因，进一步了解甲基化敏感miRNA在靶基因的表观遗传性调节中的作用，为发现大肠癌防治的表观遗传学新切入点做全新的尝试，实现基因组学与肿瘤生物学的整合。

DNA甲基化水平异常是肿瘤发生过程中抑癌基因沉默的机制之一。人大肠癌（human colorectal cancer，CRC)发生发展过程中，一种非编码微小RNA （microRNAs，miRNAs）的表达谱异常，部分miRNAs可能发挥抑癌基因的作用。在此项研究中，我们探讨了启动子区CpG岛高甲基化是否是引起miRNAs表达异常的机制之一，并筛选和鉴定与CRC发生发展相关的甲基化敏感miRNA。我们用miRNA表达芯片检测去甲基化制剂5氮脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycitidine，5-aza-dC）处理后大肠癌细胞系miRNAs表达谱的变化情况，以初步筛选候选miRNAs。由甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）和亚硫酸盐处理后基因组测序两种方法检测候选miRNA在大肠癌细胞和组织中的甲基化状态；以实时定量PCR （quantitative real-time PCR， qRT-PCR）技术检测细胞和组织中miRNA表达水平。最后，我们通过荧光素酶报告基因技术、qRT-PCR及western blot方法验证候选miRNA的靶基因。 经5-aza-dC 处理后，mir-345的表达水平显著升高。甲基化分析显示，CRC组织中mir-345 CpG岛甲基化水平显著高于正常人的大肠粘膜组织。与正常非癌组织相比较，51.6% CRC组织低表达mir-345，且表达水平与甲基化水平相关。低表达mir-345的病例淋巴结阳性率较高且病理分化较差。此外，我们验证了BCL2相关永生基因3（BCL2-associated athanogene 3，BAG3）是mir-345的一个靶基因。BAG3是一个凋亡调节因子，我们首次报道了BAG3的表达水平在CRC组织中显著升高，并与肿瘤的浸润深度相关。我们的研究提示，mir-345是CRC的一个新的甲基化敏感miRNA。 CpG岛甲基化引起的mir-345表达异常可能通过下调其靶基因参与CRC的发生发展。