基于隐窝微架构研究大肠癌microRNA表达甲基化调控及中药干预机制

肿瘤的治疗人类至今尚无良方，最好的方法是早发现、早诊断、早治疗。肿瘤的分子启动机制及早期分子标志的研究一直是肿瘤研究的重要方向，隐藏在DNA序列及之外更深层次的遗传信息的揭示，为肿瘤启动机制研究开启了新的思路。本项目是在临床患者大肠癌手术切除时，在切除的肠段上，从距离实体瘤瘤体远近不同的三个部位分别取材，进行体外培养，研究中药左金丸主要单体对隐窝微架构的维持作用，通过miRNA microarray技术，比较三个不同部位microRNA表达的不同。通过甲基化抑制剂的干预、反义RNA干扰、通过原位杂交技术及RIP-Chip技术，研究microRNA与甲基转移酶（Dnmt）之间的相互作用及调控关系。中药处理，观察Dnmt原位表达、以及microRNA与Dnmt相互作用及调控关系的变化，探讨肿瘤启示早期可能的分子机制及中药的干预机制，为进一步寻找肿瘤早期分子标志及药物治疗奠定一定的基础。

本项目是在临床患者大肠癌手术切除时，在切除的肠段上，从距离实体瘤瘤体远近不同的三个部位分别取材，进行体外培养，研究中药左金丸主要单体对隐窝微架构的维持作用，通过miRNA microarray技术，比较三个不同部位microRNA表达的不同。研究发现：1）部位2与部位1组织microRNA表达差异分析:共发现有1个miR表达差异明显：hsa-miR-3191-5p；2）部位3与部位1组织microRNA表达差异分析:共发现有57个miR表达差异明显；3）部位3与部位2组织microRNA表达差异分析:共发现有39个miR表达差异明显；建立大肠癌癌旁组织体外培养实验平台的的建立与优化（1）2-D平板培养（2）3-D培养以及TGF诱导组织块实验体系；并在此基础之研究中药单体：小檗碱和吴茱萸碱的作用，通过甲基化抑制剂的干预、反义RNA干扰、研究microRNA与甲基转移酶（Dnmt）之间的相互作用及调控关系。分别选取靶向调控Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt1不同部位表达差异较大的3个miRNA以及依据文献选取靶各这3种甲基转移酶研究较多的3个miRNA，研究在组织体外培养过程中，一定浓度的中药单体处理不同时间对这6种miRNA表达的干预作用。中药处理，观察Dnmt原位表达、以及microRNA与Dnmt相互作用及调控关系的变化，结果发现：利用TGF-β建立大肠早期癌变模型,我们检测到DNMTs在大肠早期癌变过程中表达水平下降。DNMTs的表达下调能够引起基因组DNA甲基化水平降低,导致基因组不稳定性增加并最终引发癌变发生。而左金丸的成分能够对大肠癌变早期DNMTs的表达进行干预,与未经药物处理的早期癌变组相比（即表中的TGF-β组）,经过左金丸的主要药理成分盐酸小檗碱和吴茱萸碱干预后,DNMTs的表达水平明显上调,更加接近正常水平。5-Aza-dC是临床上已有使用的去甲基化试剂,经其作用后,DNMTs的表达几乎检测不到,证实其确实能够完全抑制DNMTs的活性而发挥去甲基化作用,这为我们研究DNMTs对microRNA表达调控打下基础。经TGF-β处理后,rno-microRNA-29a,rno-microRNA-152,rno-microRNA-429的表达均明显下调,经过药物干预后三种microRNA都升高至接近甚至超过正常水平照组的0.41289以及TGF-β组的