基于中医方剂配伍理论的丹参与红花组分配伍抗脑缺血再灌注损伤的机制研究

Prescription compatibility is the core and key scientific problems in the traditional Chinese medicine (TCM) study. However, TCM prescription study just is in pieces, or a single component level, which is short of the scientific and quantitative evaluation method of component compatibility antagonistic or synergistic effect. We aim to discover the law of function of the activity component compatibility of Salvia miltiorrhiza and Carthamus tinctorius anti ischemic cerebral diseases in this project. In the present study, we test SOD、and NO in serum of the rats with colorimetry method. We detected IL-1β and P62 mRNA levels in brain tissue with RT-PCR, and the expression of TLR4 and NF-κb immunoreactivity with immunohistochemical method, and glucose metabolism change with 18F-FDG PET, and the expression of LXA4 with ELISA method, and the expression of Nrf2 with Western blot method. We deal with the efficacy above methioned by mathematic model and a calculation method. We aim to analize comprehensivly the compatibility relation and function principle of Dan-hong component compatibility, and to summarize the regularity of compatibility, and finally to confirm the best effective component compatibility, so as to provide the quantitative study and the ideas and methods of reference for TCM prescription study. In other hand, we aim to provide optional and reasonable dosage regimen for clinical treatment so as to develop innovative drugs against the cerebral ischemia diseases.

方剂配伍是中医方剂学科的核心及关键科学问题。然而，以往的中医方剂配伍研究多停留在饮片、或中药单一成分层面，定量评价中药组分配伍拮抗或协同效应较少。本项目拟开展丹参与红花活性组分配伍抗脑缺血作用规律研究，制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，核影像学18F-FDG PET监测活体脑组织的葡萄糖代谢，比色法测定血清中NO、iNOS及SOD，Western blot检测脑细胞内及细胞核Nrf2蛋白，RT-PCR检测脑细胞内P62蛋白及IL-1，免疫组化测定脑组织TLR4及NF-κb蛋白，ELISA法检测脑组织LXA4等，以上表征药效变化。通过数学多元逐步回归法拟合模型与计算研究，定量评价丹红组分配伍关系，阐明组分配伍规律，筛选丹红最佳配伍；探讨丹红组分配伍抗脑缺血损伤的作用机制。逐步实现中医方剂有效组分配伍研究定量化，为方剂配伍现代基础研究提供一定的思路与方法，优化临床给药方案，指导创新药物开发。

方剂配伍是中医方剂学科的核心及关键科学问题。本项目拟开展丹参与红花活性组分配伍抗脑缺血作用规律研究，制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，采用Western blot、免疫组化法、荧光定量PCR技术等，结合数学拟合模型进行数据分析，探讨丹红组分配伍抗脑缺血再灌注损伤的作用机制，优化丹红组分配伍，阐明丹红有效组分配伍中蕴含的作用原理及配伍规律。.本项目按照计划顺利进行，分别取得阶段性的研究成果：首先，顺利采用改良后的大脑中动脉阻塞法(MCAO)完成脑缺血再灌注损伤动物模型的建立，发现不同丹红组分配伍（丹参酮、丹参素、丹酚酸以及羟基红花黄色素）不仅能不同程度的减轻大鼠的神经功能缺损症状，还可以缩小大鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积。其次，依据以上定性指标结果，进行数理统计分析后，最后筛选出丹参与红花最佳配伍组为第九组（配伍比例关系：丹参酮240mg、丹参素320mg、丹酚酸120mg、羟基红花黄色素40mg）。按照年度计划，构建基于LXs-P62-Nrf2三个靶点的炎症反应通路，检测相关致炎因子IL-1、TLR4、NF-κb的表达变化。采用免疫组化法以及RT-PCR法检测，发现丹参与红花最佳配伍组具有作用于LXs-P62-Nrf2炎症通路，RT-PCR检测结果显示：丹参与红花最佳配伍组具有上调p62、Nrf2基因表达、下调IL-1、TLR4、NF-κb（P<0.05）的活化；NF-κb免疫组化测定结果显示，模型组海马区内有大量的NF-κb免疫反应阳性的神经元，较假手术组明显减少；治疗组的脑组织中NF-κb免疫阳性表达较明显减少。通过治疗，丹参与红花最佳配伍组具有上调Nrf基因蛋白的表达（P<0.05），丹参与红花最佳配伍组和阳性药物组无明显差异（P>0.05）。这一结果和RT-PCR检测结果保持一致，最终达到调控炎性因子表达从而抗脑缺血再灌注损伤。.通过本项目研究，明确丹红有效组分配伍抗脑缺血再灌注损伤的作用机制，指导临床合理用药，研制开发防治脑病的创新药物；阐明中药有效组分配伍之间配伍关系，为发展中医方剂配伍作用原理及其规律研究提供参考。