SpaA蛋白与猪丹毒丝菌致病性的关系及其免疫功能的研究

研究内容：①利用基因敲除技术构建猪丹毒丝菌C43065强毒株的spaA基因缺失突变株，通过毒力试验、体外吞噬试验和粘附试验验证SpaA蛋白与猪丹毒丝菌致病性的关系；②利用小鼠模型和免疫学技术检测野生型菌株、spaA基因缺失突变株和SpaA蛋白在小鼠体液免疫和细胞免疫应答中的差异；③用野生型菌株、spaA基因缺失突变株和SpaA蛋白经猪免疫保护试验从分子水平上验证SpaA蛋白的免疫保护功能。.研究意义：①验证SpaA蛋白与猪丹毒丝菌致病性的关系，阐明SpaA蛋白的粘附功能和抗吞噬功能；②从分子水平上验证SpaA蛋白的免疫保护功能。这为猪丹毒丝菌致病因子及其致病机理的研究奠定基础，并为猪丹毒的预防和治疗提供十分重要的线索。

红斑丹毒丝菌是引起猪丹毒的致病菌，给猪养殖业造成巨大的经济损失。因此，研究红斑丹毒丝菌表面蛋白的免疫功能及其致病机理，为猪丹毒的预防提供新的线索。本项目以SpaA为对象，通过免疫学方法比较了血清型2红斑丹毒丝菌C43065株SpaA及其N端342个氨基酸序列和C端160个氨基酸序列的保护作用，利用基因敲除技术构建了C43065株的spaA基因敲除株，通过小鼠致病性试验、血清敏感性试验、体外吞噬试验和粘附试验验证了SpaA与红斑丹毒丝菌致病性的关系。主要研究结果如下：.（1）小鼠保护试验结果表明SpaA的保护作用与其N端342个氨基酸序列有关；（2）小鼠致病性试验结果显示与野生株C43065相比敲除株的致病性减弱了78倍；（3）血清敏感性试验显示猪血清对敲除株的杀伤作用显著强于野生株和互补株（P<0.01）；（4）吞噬试验结果显示小鼠腹腔巨噬细胞对敲除株的吞噬能力显著高于野生株和互补株（P<0.01），而抗SpaA抗体能增强小鼠腹腔巨噬细胞对细菌的吞噬能力；（5）粘附试验结果显示与野生株和互补株相比敲除株对MEF细胞和CEF细胞的粘附能力显著降低，而粘附抑制试验结果显示抗SpaA抗体显著抑制了野生株和互补株对MEF细胞的粘附（P<0.01），但该抗体不影响敲除株的粘附能力；（6）保护试验结果显示敲除株灭活疫苗对小鼠的保护效率为野生株灭活疫苗的50%。本研究结果表明SpaA是红斑丹毒丝菌的致病因子。. 目前，国内外研究主要集中在红斑丹毒丝菌SpaA的保护作用方面，但关于其余表面免疫原性蛋白的鉴定尚未报道。因此，课题组利用免疫蛋白组学方法鉴定了C43065株菌体表面的免疫原性蛋白，并对其编码基因进行了克隆和测序。Western blot结果显示C43065株菌体表面存在9条免疫原性蛋白；MALDI-TOF质谱鉴定结果表明它们分别为SpaA、伴侣蛋白GroEL、磷酸丙酮酸水合酶、ABC转运蛋白、丙酮酸脱氢酶复合物E1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、50S核糖体蛋白L1和30S核糖体蛋白S4；DNA测序结果表明，强毒株C43065的groEL、eno、ABCt、gapC和fba基因大小分别为1614、1296、1260、1005和867 bp，与血清型1红斑丹毒丝菌相应基因的同源性高达98%。但这些免疫原性蛋白在红斑丹毒丝菌的致病过程中的作用尚未清楚。