多重耐药红斑猪丹毒丝菌中新型整合性接合元件(ICEs)及其传播机理研究

In recent years, Erysipelas disease become a new serious threat to the large-scale pig farms in our country. To address the problem, the Erysipelothrix rhusiopathiae is selected as the research object. Based on the previous research, a full-scale research about the molecular epidemiology and drug resistance characteristic of E. rhusiopathiae in our country will be carried out in this study. The important roles that the integrative and conjugative elements (ICEs) might be plaied in the multiple drug resistance E. rhusiopathiae will be further studied, for a novel ICE genetic structure was found in previous research. Further study will be carried out using Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL) PCR , overlapping PCR and bacteria whole genome sequencing technology for finding new ICEs in multiple drug-resistant E. rhusiopathiae strains. And characterization of the novel ICEs genetic diversity and genetic structure will be further studied. To clarify the transmission capacity, transmission mechanism and genetic stability of the new ICEs, the CRISPR-Cas knockout and phenotype microarray screen technology will be used in this study. Our research will not only provides some new evidences for the dissemination and horizontal transfer of resistance genes in multiple drug-resistant E. rhusiopathiae strains, but alos provides new theoretical support for prevention and control swine erysipelas disease.

当前我国规模化猪场猪丹毒病频繁爆发，成为养猪业“老病新发”的棘手问题。项目在前期研究基础上，以红斑丹毒丝菌为研究对象，拟系统开展我国红斑丹毒菌的流行病学和耐药性特征研究，探明我国不同地区红斑丹毒丝菌分布流行特征和耐药性变化规律。重点探讨整合性接合元件（ICEs）在红斑丹毒丝菌多重耐药性中的作用，在首次发现全新ICE基因结构基础上，采用交错式热不对称PCR（Tail-PCR），overlapping PCR和细菌全基因组测序等技术继续从多重耐药红斑丹毒丝菌中发现新型ICEs，表征其遗传多样性和基因结构图谱。在此基础上，采用CRISPR-Cas基因敲除技术、表型芯片扫描（phenotype microarray）等技术阐明新型ICEs的水平传播能力、传播机理和遗传稳定性等科学问题。项目研究成果不仅为红斑丹毒丝菌多重耐药性的获得和传播机理提供新证据，也可为科学防控猪丹毒疫病提供新的理论支撑。

猪丹毒疫病严重危害我国养猪业，项目以红斑丹毒丝菌为研究对象，系统开展我国红斑丹毒菌的流行病学和耐药性特征研究，探明我国不同地区红斑丹毒丝菌分布流行特征和耐药性变化规律，重点研究了整合性接合元件（ICEs）在红斑丹毒丝菌多重耐药性中的作用。项目严格按照任务书进行，项目整体进展顺利，全面完成了所有任务指标。项目执行期间，1）先后从四川，河北，湖北等省市的37个养猪场和4个屠宰场共采集样本1006份，共分离红斑丹毒丝菌231株，完成了全部分离菌株对14种药物的药敏试验和耐药基因检测，并采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术和多位点序列分型（MLST）技术对多重耐药分离菌株进行基因分型和遗传进化分析，获得我国规模化猪场红斑丹毒丝菌的流行情况和耐药性特征数据；2）采用全基因组测序技术发现红斑丹毒丝菌和其他革兰氏阳性菌中新型ICE和可移动转移元件3个，首次获得了红斑丹毒丝菌中完整的新型ICEErZJ基因环境结构图谱。首次在红斑丹毒丝菌中发现携带有mef(G)耐药基因的原噬菌体，通过基因组学比对研究阐明其遗传多样性；3）以红斑丹毒丝菌中新型ICEErZJ为研究对象，发现该ICE携带的多重耐药基因簇可通过同源重组方式整合进入Tn916-like的ICE结构中；设计引物对扩增含有Tn916-like的整合酶（Int）和切除酶（xis）基因区域用于突变体构建，结果显示整合酶（Int）和切除酶（xis）基因的突变对ICEErZJ切除和整合过程有显著影响。此外，首次发现携带有mef(G)耐药基因的原噬菌体可以形成过渡态的环化结构，帮助其水平传播；4）以获得的含有新型ICEErZJ的阳性红斑丹毒丝菌为研究对象，在不同抗性压力下，进行连续传代100代，每隔5代PCR检测一次ICE基因结构，结果表明在传代100代过程中，均未发现ICE丢失，表明新型ICEErZJ可以稳定遗传。项目部分成果已发表SCI论文11篇，中文核心期间1篇。培养博士生2名，硕士研究生4名。项目研究成果不仅为红斑丹毒丝菌多重耐药性的获得和传播机理提供新证据，也为科学防控猪丹毒疫病提供新的理论支撑。