20-羟二十烷四烯酸在心肌缺血再灌注损伤中的来源及作用机制研究

Myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) is an important issue in clinical treatment of ischemic cardiomyopathy.In recent years, studies found that the overproduction of 20-hydroxy eicosatetraenoic acid (20-HETE) in MIRI increased myocardial injuries, but the mechanism was unclear yet. This study intends to establish rat in vivo, in vitro and cell-level models of MIRI, in order to firstly verify what isoform of cytochrome P-450 (CYP450) are activated in MIRI and reveal the source of 20-HETE overproduction, thus improving cardiac function by using gene interference (RNAi) method at the cellular level. Secondly, by using molecular biology and patch-clamp technique at the myocardial cellular level, this study intends to investigative the relationship of 20-HETE and angiotensin II (AngII) and δPKC in the process of induced myocardial apoptosis, clear upstream factors and downstream targets, establisha AngII → CYP450 → 20-HETE →δPKC signaling pathway at the cellular level, and validate it in the model of MIRI, thereby eventually illuminate the molecular and cellular mechanism of 20-HETE in aggravating MIRI. This study will provide a theoretical basis for MIRI pathogenesis and provide effective new targets for drug pretreatment in clinical treatment of ischemic cardiomyopathy.

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是临床治疗缺血性心肌病面临的重要问题，近年研究发现在MIRI中20-羟二十烷四烯酸（20-HETE）过量生成，加重心肌损伤，但机制尚不清楚。本研究拟建立大鼠在体、离体和细胞水平的MIRI模型，首先探明在MIRI中哪种细胞色素P-450（CYP450）亚型被激活，揭示20-HETE过量生成的来源问题，继而细胞水平采用基因干预（RNAi）方法，改善心肌功能；其次，在心肌细胞水平应用分子生物学、膜片钳等技术，研究20-HETE在诱导心肌细胞凋亡进程中与血管紧张素II（AngII）和δPKC之间的作用关系，明确上游影响因素和下游作用靶点，拟在细胞水平确立AngII→CYP450→20-HETE→δPKC的信号通路，并在MIRI模型中加以验证，最终阐明20-HETE加重MIRI作用的分子细胞机制。通过本课题研究为临床治疗缺血性心肌病提供有效的预处理药物作用新靶点。

研究发现在心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中，20-HETE含量增高，抑制其合成可有效降低再灌注后心肌梗死面积，但在MIRI进程中20-HETE生成来源及其加重心肌损伤的机制尚不清楚。.本研究首先在整体、离体MIRI以及细胞缺氧/复氧模型研究中发现：①再灌注后大鼠心肌组织中CPY4A1、4A2、4A3的mRNA及蛋白表达明显升高，20-HETE含量显著增多，而CYP4F基因和蛋白表达无明显改变，表明在大鼠MIRI中，主要通过激活CYP4A酶诱导20-HETE生成。②抑制20-HETE的生成后，显著减少了再灌注后心梗面积的发生，心肌动力学指标显著恢复，同时缺氧/复氧后心肌细胞凋亡率显著下降，其机制与20-HETE诱导的细胞凋亡以及ROS生成、蛋白质羰基化和脂质过氧化密切相关。.在细胞水平研究发现：①20-HETE在诱导心肌细胞凋亡的同时还具有明显的促进心肌肥大效应。加入CaMKII特异性阻断剂KN-93，可显著抑制20-HETE诱导的细胞凋亡和心肌肥大。进一步研究发现，20-HETE具有激活CaMKII作用，从而导致心肌细胞内相关钙离子调节蛋白（RyR2、SERCA2a）表达改变，引起细胞内钙离子调控紊乱，造成钙超载，最终诱导细胞凋亡与肥大。②AngII具有显著促进心肌细胞凋亡与肥大作用，本研究在培养的乳鼠心肌细胞和H9c2心肌细胞系中发现，AngII可促进心肌细胞CYP4A表达增高、20-HETE生成增多，20-HETE通过诱导ROS生成、线粒体损伤等机制参与AngII诱导的心肌细胞凋亡和肥大。③研究发现δPKC的激活会诱导细胞凋亡，本研究发现20-HETE具有显著增加δPKC表达和激活作用，应用δPKC抑制剂卡马拉素后显著抑制了20-HETE诱导的心肌细胞凋亡以及对L-型钙离子通道的激活作用，改善了20-HETE引起的离体心肌力学指标下降。表明20-HETE所引起的心肌损伤与激活δPKC信号通路相关，但深入机制还需进一步研究。.本研究观察了在MIRI进程中20-HETE生成的源头问题，探究了20-HETE诱导心肌细胞凋亡与肥大的机制，以及与AngII、δPKC的交互作用关系，为阐明20-HETE加重MIRI的分子细胞机制提供了理论基础。