脑缺血PSD-95酪氨酸磷酸化对突触后Src信号网络的调控

申请者前期研究表明，脑缺血及再灌注引起PSD-95第523位酪氨酸残基（Y523）的磷酸化，这一磷酸化作用上调NMDA受体的功能。为深入阐明PSD-95酪氨酸磷酸化在缺血性脑损伤中的作用机制，本研究拟采用生物化学、分子生物学、膜片钳电生理学、组织学等方法，在分子、细胞和整体水平研究PSD-95Y523磷酸化对突触后Src信号网络的调节作用，主要研究内容包括以下几个方面：（1）PSD-95Y523磷酸化对Src的活性、转位及功能的调节；（2）PSD-95与Src信号网络中重要蛋白质的相互作用及PSD-95Y523磷酸化的调节作用；（3）脑缺血PSD-95与Src信号网络的相互作用在HPK1-MLK3-JNK3信号通路的激活及神经损伤中的作用。通过以上研究最终阐明缺血性脑损伤中的关键信号通路，筛选潜在的药物治疗靶点。

缺血性脑血管病（脑中风）严重危害人类生命和健康，目前仍缺乏有效的神经保护措施。本项目采用生物化学、分子生物学、组织学、膜片钳电生理学等方法，从分子、细胞和整体水平阐明了PSD-95Y523磷酸化在缺血性脑损伤中的作用机制，主要研究内容和重要结果包括以下四个方面：（1）观察了Src/Fyn介导PSD-95Y523磷酸化在缺血性神经元损伤中的作用，发现特异性Src或Fyn的siRNA均抑制PSD-95Y523磷酸化并有显著的神经保护作用。（2）研究了PSD-95Y523磷酸化对Src的活性、转位和功能的调节作用。研究发现，NMDA受体活化引起PSD-95Y523磷酸化，促进Src的自身磷酸化（Y416）从而上调Src激酶的活性；但是，PSD-95Y523磷酸化不影响PSD-95与Src、NMDA受体亚基NR2A的结合，提示这一磷酸化作用不改变Src在兴奋性突触后区域的分布；活化的Src磷酸化NR2A，促进NMDA受体的开放。（3）阐明了PSD-95Y523磷酸化对突触后Src信号网络的调节机制。研究表明，PSD-95Y523磷酸化有利于Src上游激酶Pyk2与PSD-95的结合，增强Pyk2 的活性，进而上调Src激酶的活性；HPK1是Src的底物，本研究发现PSD-95与HPK1没有直接的相互作用，但脑缺血后HPK1的表达水平明显升高，其作用及机制有待深入探讨。（4）探索了Src信号在GluK2－MLK3－JNK3信号通路的激活及神经损伤中的作用。据报道，缺血后处理明显改善缺血后的神经功能，本研究表明缺血后处理通过PI3K－Akt通路，抑制GluK2－PSD-95－MLK3－JNK3信号级联，最终减少海马CA1区神经元的丢失;Src磷酸化海人藻酸受体亚基GluK2，促进GluK2受体介导的钙内流并激活促凋亡MLK3－JNK3信号。总之，以上结果表明：脑缺血或NMDA受体活化诱导PSD-95募集Src家族激酶，磷酸化PSD-95（Y523），使其募集并激活Pyk2，正反馈调节Src家族激酶的活性，进而诱导胞内钙离子超载并激活促凋亡MLK3－JNK3通路；Pyk2/Src－PSD-95和PSD-95－MLK3复合体是神经保护的潜在药物靶点。本项目研究为脑缺血的神经保护治疗提供了新的思路。