百合热激转录因子基因克隆及功能分析

百合作为主要的切花和盆花材料，在国际花卉市场上占有重要地位，但百合喜冷凉湿润气候，在夏季生产中常因高温，造成幼苗生长停滞、植株低矮、花朵败育等，严重影响了切花质量并造成种球退化，成为限制国内百合周年生产的重要因素。对模式植物拟南芥和蕃茄的研究表明，热激转录因子HSF调节热激蛋白和抗氧化酶APX的表达，与植物耐热性关系密切，蕃茄中过表达和抑制表达HSFA1分别提高和降低了植株耐热性，拟南芥HSFA2过表达和Knockout株系的耐热性也分别增强和减弱。鉴于高等植物细胞水平的保护机制和基因功能具有严格的保守性，本项目拟克隆百合HSF基因，在拟南芥中过表达验证百合HSF基因功能，研究HSF提高植株耐热性的作用机理。最后，将HSF功能基因转入百合，为通过基因修饰手段有效提高百合的耐热性，创造优良的、具有自主知识产权的百合种质资源奠定基础。

百合作为主要的切花和盆花材料，在国内外花卉市场上占有重要地位。但是百合性喜冷凉湿润气候，在夏季生产中常因高温造成植株矮小、病虫害严重、花败育等现象，严重影响切花质量并造成种球退化，成为限制我国百合周年生产的重要因素，因此，利用分子育种，将耐热相关基因转入百合，培育百合耐热新品种是解决该限制因素的重要途径。在其他作物上的研究表明，热激转录因子HSF为热激信号转导的最下游，能够调节热激蛋白和抗氧化酶基因APX的表达，与植物耐热性密切相关。本研究针对国内主栽的百合品种耐热性差的问题，通过三年的系列试验，克隆了百合热激转录因子（HSF）家族成员中HsfA2a、HsfA2b和HSF1基因，克隆了抗氧化酶基因APX和茉莉酸合成相关基因AOC，还克隆了百合钙调蛋白CaM基因，并对这些基因进行了序列、时空表达、基因转录活性分析和蛋白质亚细胞定位以及过表达这些基因的拟南芥的耐热性等基因功能的验证与分析。结果表明：百合HSF1和AOC基因为组成型表达，HsfA2a、HsfA2b为特异型表达，它们均能被热激胁迫诱导表达。亚细胞定位显示HsfA2a、HSF1均定位在细胞核中，进一步证实了它们为转录因子，AOC基因定位在细胞膜和质体中，CaM定位在细胞质和细胞核中。热激转录因子能够显著提高转基因拟南芥的耐热性，而且其作用与热激蛋白基因、抗氧化酶基因APX、茉莉酸合成相关基因AOC的表达密切相关；对钙调蛋白CaM基因的研究表明，LlCaM3是百合热激信号转导的重要组分，很可能在热激转录因子上游发挥作用。这些基因在拟南芥中的功能验证，为筛选耐热基因转化百合提供了基础。我们还建立百合胚性愈伤途径的遗传转化体系，其研究结果对解析百合耐热性方面的作用机理，全面了解植物热激转录因子的生物学功能提供理论了依据，同时为通过基因修饰手段来.提高百合的耐热性提供新的研究途径并奠定了技术基础。