组蛋白分子伴侣FACT对染色质结构及基因功能调控的分子机制研究

In eukaryotes, genomic DNA is highly packaged into chromatin by histones to fit inside the nucleus. Dynamics of the chromatin structure plays a critical role in all DNA-related biological processes including transcriptional regulation, DNA replication, DNA damage and repair. The histone chaperone FACT (Facilitates chromatin transcription) has been characterized to play a pivotal role in almost all chromatin-related processes. Although the interactions between several distinct domains of FACT and histones or DNA have been elucidated separately by structural and biochemical investigations, how FACT interacts with nucleosome and chromatin to function in gene regulation still remains to be clear. In this project, based on an in-vitro nucleosome and chromatin reconstitution system we have successfully developed, we are going to extensively investigate the molecular mechanism of FACT interacting with nucleosome and chromatin and its epigenetic regulation using molecular biology, biophysics and biochemistry techniques, including the analytical ultracentrifugation, EM/cryo-EM and single-molecular FRET imaging and magnetic tweezers. In addition, we plan to intensively investigate the in-vivo biological function of these processes by using the biochemistry, cell biology and genome-wide sequencing techniques. Through this study, we will try to improve our established research platform to investigate the structure and dynamic regulation of nucleosome and chromatin, and to identify the molecular mechanism of FACT functions in gene transcription and replication at chromatin context. Furthermore, based on the findings that FACT elevation in multiple tumors, including breast cancer and ovarian cancer, correlates with markers of aggressive subtypes, our investigation will also help to understanding the mechanism by which FACT facilitate tumor growth.

真核细胞中DNA的生命活动包括基因转录和复制等，都在染色质上进行。研究发现FACT在所有涉及染色质的DNA生命过程中都发挥重要作用。虽然FACT及其亚基SPT16或SSRP1与不同组蛋白或DNA的作用模式已有一些研究，但是FACT如何与核小体或染色质相互作用，及它是如何在染色质水平上的基因调控中发挥生物学功能目前仍然不清楚。本项目基于染色质体外重建系统，应用生物物理和生物化学技术包括分析超速离心、冷冻电镜、单分子技术等，系统研究FACT对核小体和染色质的调控及其受各种因子调控的分子机制；同时结合生物化学、细胞生物学和全基因组测序分析技术，深入探讨FACT及其调控因子在染色质水平上基因转录过程中的生物学功能及作用机制。鉴于FACT在肿瘤细胞如乳腺癌和卵巢癌等中异常高表达，与肿瘤发生发展密切相关；我们深入探讨FACT作用机制对理解这些疾病发生发展和治疗具有重要指导意义。

FACT复合物，作为组蛋白H2A/H2B的分子伴侣，在所有涉及染色质结构基础上的DNA生命过程，包括基因的转录、复制、损伤修复中都发挥至关重要的作用。但是，对于FACT如何与染色质相互作用，进而在染色质水平上调控基因功能的分子机制目前仍然不清楚。本项目研究基于染色质体外重建系统，并结合生物化学、细胞生物学和表观组学研究，系统的探讨了FACT对核小体和染色质结构及功能的调控机制。我们研究发现H2AK119单泛素化修饰（ubH2A）通过空间位阻作用显著稳定核小体结构，并且一个泛素修饰稳定一个外半圈（JACS，2020）。进一步研究发现ubH2A修饰可以显著抑制FACT与核小体结合，进而抑制FACT对核小体结构的重塑作用。但是ubH2A并不抑制FACT对H2A/H2B的组装作用；FACT可以将带有泛素修饰的ubH2A/H2B组装进入染色质，形成稳定的ubH2A核小体，进而抑制基因的转录（NAR，2022）。有意思的是，同样是单泛素化修饰，ubH2B与ubH2A的作用截然相反。我们发现ubH2B可以显著增强FACT与核小体的结合，并且拮抗FACT破坏核小体稳定性的作用。FACT结合到ubH2B核小体上后，形成一个结构稳定且可重复拉伸的核小体状态，并促进基因的转录；同时ubH2B还显著促进FACT的分子伴侣功能，促进FACT结合H2A/H2B并将其组装形成ubH2B核小体（Nature Commun. In revision）。同时，我们深入探讨了靶向FACT的新型抗癌药物小分子Curaxin CBL0137对DNA及其与FACT作用调控的分子机制，发现CBL0137可以通过嵌入DNA碱基对，显著增强DNA双链结构的稳定性，并调节DNA的弯曲扭转物理特性；同时CBL0137可以特异性增强FACT与DNA的相互作用，但抑制CTCF与DNA的结合（Biochemistry 2021）。我们的系列研究工作为深入理解FACT复合物的作用机制及其在相关疾病发生发展和治疗中的作用奠定了坚实的基础。