ARF-GEF介导囊泡转运过程参与气孔发育调控机制研究

Stomata are plant-specific epidermal structures that control gas and water exchange between plants and the atmosphere. Stomatal development involves a series of cell divisions and differentiation, which provides an ideal research system for understanding the development of multicellular higher plants. Endomembrane vesicular trafficking mediates many aspects of plant development, however the roles of which in regulating stomatal development is far from clear. ARF-GEFs are ADP-ribosylation factors (ARF small GTPases) guanine nucleotide exchange factors that play regulatory roles in endomembrane vesicular trafficking. Arabidopsis ARF-GEFs can be classified into GBF- and BIG-subfamilies. Mutation of GBF-subfamily GNOM induced the formation of small stomatal lineage cells and stomata clusters, a similar phenotype that is observed in the mutant of BASL as well. Furthermore, mutations of multiple BIG-subfamily genes caused stomata clusters in leaves but suppression the production of stomata in hypocotyls compared with wild-type, indicating that the ARF-GEF family proteins have diverse but redundant roles in regulating the organ-specific stomatal development. In this study, we will employ molecular biology, biochemistry, cellular biology and genetics strategies to study whether the subcellular localization of key stomatal regulators, such as BASL and BRI1, are regulated by ARF-GEF mediated vesicular trafficking pathway. The results of this study will enrich our understanding of the function of ARF-GEF mediated vesicular trafficking in signaling pathway and stomatal development.

气孔是植物地上表皮上的一种特殊的结构，在调节光合作用和蒸腾作用中发挥着重要的作用。气孔的形成经历多种细胞分裂和分化，是研究植物发育理想系统。内膜囊泡运输介导众多的发育调控，但是否参与气孔发育调控还不清楚。ARF-GEF是小G蛋白ADP核糖基化因子的鸟苷酸交换因子，参与囊泡运输调控。拟南芥ARF-GEF包含GBF和BIG两个亚家族。我们前期研究结果显示GBF亚家族的GNOM基因突变所导致气孔世系小细胞群和气孔簇表型，与极性蛋白BASL突变体表型相似。BIG亚家族多基因突变也导致了叶片气孔簇形成，但却抑制了下胚轴气孔产生，表明ARF-GEF蛋白参与调控气孔发育功能各异并有器官特异性。本项目拟利用分子生物学、生物化学、细胞生物学和遗传学等方法，通过验证ARF-GEF是否介导了气孔发育调控蛋白，如BASL、BRI1受体蛋白的囊泡运输过程，揭示ARF-GEF依赖的囊泡运输参与气孔发育的信号调控途径。

细胞极性在植物生长发育过程中发挥着非常重要的作用。在该项目执行的过程中，我们获得多个重要的研究结果。主要包括以下三个方面：第一，我们总结在植物生长发育发挥作用的极性蛋白以及它们在质膜上极性定位的机制。主要包括囊泡运输、细胞骨架活性、蛋白磷酸化等调控机制。对一些重要的调控因子的调控机制进行重点介绍，我们还对今后细胞极性的研究领域的热点问题进行讨论。第二， 我们证明了PRAF/RLD能够和BASL蛋白互作，并且在praf四突变体背景下，BASL蛋白的极性定位消失；PRAF8在气孔世系细胞中极性定位，但是当BASL基因突变以后，PRAF8的极性定位就消失。并且我们的研究还发现praf的四突变和gnom突变体的表型相似，并且GNOM蛋白能够和PRAF蛋白在细胞质中互作。因此，在气孔发育过程中，我们提出了BASL和PRAF蛋白正反馈调控机制，和GNOM和PRAF形成的复合体对于BASL蛋白极性定位的调控机制。第三，我们证明了内质网中的 SDF2-ERdj3B-BiP复合体对ERECA家族成员的不同调控机制。我们利用药剂处理、细胞生物学以及生物化学等方法证明ERECA蛋白在erdj3b突变体背景下蛋白的丰度减少，但是蛋白的动力学却没有受到影响。相反在erdj3b突变体背景下，ERL1和ERL2蛋白滞留在内质网中。所以，我们认为在气孔发育过程中，内质网中的蛋白质量控制系统主要作用是保持ERECTA的丰度，同时确保ERL1和ERL2蛋白能正确的定位到质膜上发挥功能。