利用fsp1 突变体研究气孔发育后期对称分裂的调控网络

Arabidopsis four lips (flp-1) is one of the earliest found stomatal mutants. Mutation of FLP gene leads to extra divisions within guard mother cells. As a MYB transcription factor, FLP could directly regulate the transcrition of CDKB1;1,CDKA;1 and CYCA2;3 . However, the molecular mechanism of how FLP regulates the GMC symmtric division at the terminal stage of stomatal development has not been fully discovered. By the means of forward genetic approaches, we isolated a flp-1 fsp1 mutant from the populations of EMS mutagenesis, in which the stomatal defective phenotype of flp-1 was suppressed. We have identified this gene using the map-based cloning. Trasformation of a construct harboring FSP1 was able to reverse the stomatal defects of flp-1 fsp1 plants to that of flp-1 muants. Single mutant of fsp1 exhibits defective divison in guard mother cells, suggesting that FSP1 is involved in FLP-regulated terminal symmetric divison of stomatal development. Using approaches of molecular, biochemical and cellular biology, we will probe the interaction between FSP1, FLP and cell cycle genes. The results for the above study will further enrich our knowledge about the fine regulation of cell symmetric diviosn happened in stomatal development.

拟南芥气孔由一对保卫细胞组成。four lip（flp）突变体是最早发现的气孔突变体之一，FLP基因突变导致保卫细胞母细胞冗余分裂，形成异常的多细胞气孔结构。已有结果表明FLP作为MYB转录因子可直接负调控CDKB1;1、CDKA;1、CYCA2;3基因转录，但FLP所参与的气孔发育后期的对称分裂调控机制尚不清楚。我们采用正向遗传学方法对flp-1突变体进行了EMS诱变，从诱变群中筛选到一个可抑制flp-1气孔表型的突变体植株flp-1 fsp1，并完成该基因的图位克隆。转化FSP1能够使flp-1 fsp1的植株重现flp-1气孔表型。fsp1单突变体也表现出保卫细胞母细胞分裂缺陷,表明FSP1参与了FLP所调控的气孔发育后期细胞分裂。我们拟利用分子生物学、生物化学和细胞生物学等技术，对FSP1与FLP及细胞周期蛋白的关系进行解析，期待能进一步揭示气孔发育中对称分裂的精细的分子调控机制。

气孔是调节植物体内外气体交换的重要表皮结构。气孔的发育包含多种不对称分裂和唯一的一次对称分裂。FOUR LIPS (FLP)MYB家族转录因子和其同源基因MYB88在调控气孔对称分裂过程中发挥着非常重要的作用。FLP基因突变导致保卫细胞母细胞发生冗余分裂，在弱突变体flp-1的子叶中大约有40%的气孔由4个挨在一起的保卫细胞组成。为了对FLP的整个调控网络进行深入的研究，本项目中我们对flp-1进行EMS诱变，我们筛选到一个FLP的抑制子，命名为FSP1。该基因突变大大抑制了flp-1突变体的表型。在该项目中我们的研究发现：第一、FSP1基因编码拟南芥RPA2a蛋白，该蛋白是RPA复合体的一个重要的亚基，参与DNA的复制、修复以及重组过程。第二、RPA2a和FLP的直接靶蛋白CDKB1;1/CYCA2;3复合体协同调控气孔发育对称分裂、保卫细胞的大小以及DNA的核内复制等过程。第三、RPA2a蛋白能和CDKB1;1/CYCA2;3复合体相互作用，并且受到CDKB1;1复合体的直接磷酸化的调控。RPA2a的N端区域是磷酸化的区域，并且Ser11和Ser21是其保守的磷酸化位点。RPA2a:PRA2aS11,21/D-GFP能够部分互补cdkb11;11;2双突变体的GMC分裂缺陷表型。以上研究结果揭示了RPA2a受到CDKB1;1复合体磷酸化调控的保守的调控机制。另外，我们的研究还发现：拟南芥中RPA2有两个同源基因，RPA2a和RPA2b。这两个基因在植物生长发育过程中的表达模式相似，都是在细胞分裂比较旺盛的细胞中有较高的表达水平，并且在整个胚胎发育过程中都有表达。双突变体表现出胚胎致死的表型，并且胚乳细胞核分裂异常。因此，我们的研究结果揭示RPA2蛋白不仅参与气孔发育过程还参与植物胚胎发育过程调控。