肾上腺髓质素在肺癌血管生成和细胞增殖中作用的研究

肿瘤细胞增殖和血管生成是肿瘤生长、转移的重要机制。血管活性肽-肾上腺髓质素（ADM）在多种肿瘤细胞和成瘤动物中表达，我们已往承担的国家自然科学基金项目（NO.39770342）初步证实，肺癌病人血浆ADM表达增高，提示ADM参与了肺癌的发生发展，但ADM对肺癌细胞增殖及肿瘤血管生成的作用及其机制尚无系统研究。本课题从临床病人、实验动物、细胞培养、分子水平四个层面，采用放射免疫分析、免疫组化、Western-blot、实时荧光定量-PCR、基因沉默等多种技术，观察：1.肺癌病人、成瘤动物血浆和支气管肺泡灌洗液及体外培养的肺癌细胞上清液中ADM含量；2.病人肺癌组织、裸鼠肿瘤中ADMmRNA、ADM-R的表达及与瘤体内微血管密度变化的相关性；3.ADM及受体在肺癌细胞中的表达及对细胞增殖的影响。较全面阐明ADM是否为新的肺癌细胞增殖和血管生成调节因子，ADM可否成为肺癌治疗药物作用的新靶点。

本项目是在本研究小组以往工作的基础上，体外原代培养人胚肺成纤维细胞（HFLF）、HUVEC和肺癌H1299细胞系，免疫组化观察HFLF中肾上腺髓质素（AM）的蛋白表达；RT-PCR方法检测HFLF、HUVEC和H1299细胞中AM及AM受体相关蛋白ADMR、CRLR、RAMP1、RAMP2和RAMP3的基因表达。采用MTT方法观察细胞培养24、48和72小时，AM及TGF-β1对人胚肺成纤维细胞增殖的影响。采用Real-time quantitative PCR方法观察AM及转化生长因子β1（TGF-β1）对人胚肺成纤维细胞c-myc、Ι型前胶原基因α1 （α1(I) procollagen, COL1α1）、Ⅲ型前胶原基因α1（α1(Ⅲ) procollagen, COL3α1）基因表达的影响。采用Western blot方法观察AM及TGF-β1对人胚肺成纤维细胞p-SMAD2/3蛋白表达的影响。结果表明，AM及AM受体ADMR、CRLR、RAMP1、RAMP2和RAMP3基因在HFLF、HUVEC和H1299细胞中表达不同。细胞培养24、48、72小时，AM 200nM抑制HFLF增殖，且AM可以抑制TGF-β1 5ng/ml的促增殖效应。24、48、72小时，AM的抑制作用呈下降趋势，而TGF-β1的促增殖作用呈上升趋势，推测二者在调节HFLF增殖中发挥作用的时限并不同步。TGF-β1可以刺激肺成纤维细c-myc、COL1α1、COL3α1基因和p-SMAD2/3蛋白表达，提示c-myc表达升高可能是TGF-β1促成纤维细胞增殖的机制之一，p-SMAD2/3可能是TGF-β1促肺成纤维细胞胶原基因表达的重要信号转导蛋白。AM可以抑制基础条件下和TGF-β1促进的c-myc、COL3α1基因表达的升高，同时AM抑制SMAD2/3的磷酸化，即抑制TGF-β-SMAD信号转导通路的激活，提示这可能是AM拮抗TGF-β1的作用以及抑制成纤维细胞增殖和胶原基因表达的机制之一。