枯萎病菌胁迫下的黑籽南瓜抗性基因表达差异及NBS类关键基因功能鉴定

Fusarium wilt is an important disease that affects the quality and yield melons, and it lacks the resistance of genetic resources in China, if breeding disease-resistant varieties need to look for more resources of resistance genes. Cucurbita ficifolia has the strong resistance to the fusarium wilt of melons , and it is an ideal material to screen resistance to fusarium wilt genes . The project is on the basis of screening fusarium wilt -resistant materials of Cucurbita ficifolia successfully in early, using the method of genomics and transcriptome analysis to carry out the following research: First search the conserved sequences of NBS in the genome database of cucumber and melon, then design the degenerate or specific primers and clone the resistance gene analogs of Cucurbita ficifolia. Second, use the RGA cloned contrasting to the differentially expressed genes interacting with blight on Cucurbita ficifolia, micry the scope of screening, and target the key different expressed genes of NBS quickly; after the validation of quantitative PCR,use RACE technology to obtain full-length gene; Finally use the gateway technology to build the key genes of interference carrier and plant expression vector of RNAi , and transform the high resistant and infected materials for genetic, then confirm the function of genes in the end.The project can parse the molecular mechanism of the affinity interactions between Cucurbita ficifolia and fusarium wilt, at the same time provide gene resources for the prevention and control fusarium wilt of melons in the long time.

枯萎病是影响我国瓜类品质和产量的重要病害,且该病抗性遗传资源缺乏，培育抗病新品种需要寻找更多的抗病基因资源。黑籽南瓜对瓜类枯萎病抗病力强，是筛选抗枯萎病基因的理想材料。该项目在前期成功筛选黑籽南瓜高抗枯萎病材料的基础上，采用基因组学结合转录组学分析的方法，拟开展以下研究，首先搜索黄瓜和甜瓜等基因组数据库中的NBS类基因保守序列并设计简并或特异引物，克隆黑籽南瓜抗病基因同源片段（RGA）；二是利用克隆的RGA对比转录组测序筛选到的黑籽南瓜与枯萎病菌互作的差异表达基因，缩小筛选范围，快速锁定NBS类关键差异表达基因；采用荧光定量PCR验证后，RACE技术获得全长基因；最后利用gateway技术构建关键基因的RNAi干涉载体和植物超表达载体，对黑籽南瓜高抗和感病材料进行遗传转化、最终确认基因功能。项目可解析黑籽南瓜与枯萎病菌二者之间非亲和互作的分子作用机制；同时为持久防控瓜类枯萎病提供基因资源。

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是重要的抗枯萎病种质资源，曾有效的控制了黄瓜枯萎病的发生和危害，研究黑籽南瓜响应枯萎病胁迫的分子机理，可为防控瓜类枯萎病提供新的基因资源和奠定抗病理论基础。本项目前期通过对枯萎病菌胁迫下的白皮、花皮和绿皮黑籽南瓜NBS同源序列表达及抗氧化酶差异分析，阐明了3种类型黑籽南瓜的抗病生理机制。在此基础上，项目采用二代和三代RNA-seq技术对高浓度（1ｘ108个·mL-1）枯萎病菌侵染下2d和4d的抗性材料绿皮黑籽南瓜进行转录组测序，项目增加了蛋白组测序内容，从基因和蛋白水平探讨黑籽南瓜应答枯萎病菌的分子机制。转录组测序总共组装得到62 169条Unigene，共有47 521条unigene获得注释。对接种枯萎病菌后2d、4d相对于CK 的差异表达基因进行筛选鉴定出1850个差异表达基因（DEGs）。在接种枯萎病菌2天的叶片中有821个差异表达基因。在接种枯萎病菌4天的叶片中有1695个差异表达基因。有666个基因在接种枯萎病菌2天和4天的叶片中均变现出差异表达的趋势。大量基因被注释为激素相关基因，如响应乙烯的转录因子、生长素响应因子、脱落酸受体等。同时也有部分基因被注释为转录因子，涉及到MYB、WRKY、bHLH、LUX、MYB等转录因子家族。GO富集结果表明，444个差异表达基因共富集到了689条GO term；对2d和4d共同差异表达的444个基因进行KEGG代谢通路富集，共有97个基因获得KEGG注释，其中54个基因被显著富集（p≤0.05）到26条通路上。蛋白质组分析结果表明，相较于对照共计鉴定出356个差异积累蛋白（DAPs）。有86个蛋白在接种枯萎病菌2天和4天的叶片中均变现出差异表达的趋势，其中多数被注释为氧化还原蛋白或过氧化物酶。结合转录组和蛋白质组数据关联分析，项目初步阐明了绿皮黑籽南瓜抗病信号转导途径和相关应答机制，为瓜类枯萎病抗性机制研究提供了参考信息。项目获得了快速响应枯萎病菌胁迫的9个NBS 类抗性基因，并采用VIGS技术结合荧光定量PCR初步明确了CfNRF2基因的表达特性和基因功能，为利用黑籽南瓜进行抗病新品种培育和防控瓜类枯萎病提供了有用的抗性基因资源。