2C解旋酶在肠道病毒感染中关键功能的结构基础

2C helicase is highly conserved in Enterovirus and plays key roles in virus life cycle, however, it remains one of the least understood proteins. 2C participates several key events, including virus uncoating, genome replication, immune evasion, encapsidation and virulence. Nevertheless, the three-dimensional structural information of 2C is completely missing in enteroviuses and the entire picornaviruses, which limits the understanding of protein function and impedes inhibitor design. The current project will focus on EV71-2C. Utilizing the methods of structural biology, biochemistry, biophysics and virology, we will determine the prototype structure of 2C to reveal the structural basis for the biding to NTP, RNA, protein partner and drugs. The proposed findings will provide direct evidence and molecular details to the role of 2C in virus replication and immune evasion, and offer an essential structural framework for drug design. The proposed project has solid ground of preliminary investigation. We solved a major technical obstacle of the intrinsic instability of 2C by establishing a highly efficient and soluble expression of 2C protein and obtained the preliminary conditions for 2C crystallization, thus providing the essential preconditions for the initiation of the project. The applicant of this project has multiple years of experience for structural and functional studies of Enterovirus encoded proteins with outstanding results. The technique platforms for structural and virological studies are well established.

2C解旋酶是肠道病毒生命周期中功能最重要，序列最保守但了解最少的蛋白之一。2C参与了病毒脱壳，基因组复制，免疫逃逸，衣壳组装和形态发生等关键过程，是药物设计的理想靶标。然而在肠道病毒乃至整个微小RNA病毒科中，2C的三维结构信息完全缺失，限制了功能的研究进展，阻碍了抑制剂的设计。本申请以EV71-2C为突破口，利用结构生物学，生物化学，生物物理学及病毒学的实验手段，拟解析首个2C蛋白原型结构，揭示2C识别NTP，RNA，蛋白质配体和药物的结构基础，为阐明2C在病毒复制和免疫逃逸中扮演的角色提供直接证据和精确的分子细节，为药物设计提供基本的结构信息框架。本项目前期工作基础扎实，已解决2C蛋白高度不稳定的技术难点，获得了可溶、高效的2C表达体系，初步摸索到2C结晶线索，具备本项目顺利实施的必要基础。申请人具备多年肠道病毒编码蛋白结构与功能研究经验，成果丰硕，结构学和病毒学等关键技术平台齐备。

肠道病毒是人类健康的重大威胁。EV71是手足口病的主要病原体。自2015年，手足口病年新发病例接近200万例，位居丙类传染病之首。尽管PV疫苗效果较好，世界卫生组织发起了“脊髓灰质炎根除计划”至今仍无法实现目标。因此，抗病毒药物是疾病控制的重要手段。然而,至今无有效的肠道病毒药物。肠道病毒2C蛋白是最保守的非结构蛋白之一。2C参与了病毒脱壳、RNA合成、免疫逃逸及包装等过程，是理想的药物靶标。本项目聚焦多个肠道病毒2C蛋白的结构、功能及在复制中的作用，主要研究成果：（1）成功解析了EV71 2C结构，是肠道病毒属以及小RNA病毒科的首个2C结构，实现了相关领域“从0到1”的突破。EV71 2C由ATP酶结构域，锌指和C端两亲性螺旋构成。ATP酶和锌指之间形成疏水口袋与另一个2C分子C端alpha螺旋结合，介导了2C自我多聚化，是ATP酶活性和病毒复制的前提条件；构建了EV71 2C六聚体模型，提出了2C-RNA相互作用模式和2C成熟化剪切的机制假说。（2）成功解析了肠道病毒第二个2C结构，PV 2C晶体结构；PV 2C包含了ATP酶结构域，锌指及C端alpha螺旋，通过C端alpha螺旋与另一个2C分子表面疏水性口袋结合发生多聚，是2C活性的前提条件；因此提出阻断2C多聚化是潜在的抗病毒策略；为理解抑制剂作用机制，耐药机制和药物设计提供了重要依据。本项目相关研究成果以通讯作者在Science Advances 2017（IF=12.8，第一标注）和PLOS Pathogens 2018 （IF=6.5，第三标注）等学术期刊发表2篇研究论文。已培养2名研究生毕业，其中1名博士生获得2017北京市优秀博士生称号和2018北京协和医学院优秀博士论文奖。近十余年以来，大量研究工作发现2C蛋白是许多抑制剂作用靶点，但机制不明。我们解析的2C结构为揭示抑制剂作用机制，耐药机制以及抑制剂优化设计提供了期待已久的三维结构信息。PLOS Pathogen杂志官方网站将我们发表的论文置于页眉位置进行展示，体现了这些研究工作的重要性。