肠道病毒解旋酶在囊泡膜上组装六聚体及催化双链RNA解旋结构基础

The applicant previously determined the first 2C helicase structure of Picornavirus"crystal structure of EV71-2C without N-terminal membrane binding region". We found that the assembly of full-length 2C hexamer is fundamental to 2C activity and EV71 replication; the N-terminal membrane binding region is important to hexamerization. In order to understand the role of 2C in EV71 replication, we will investigate nature conformation of full-length 2C hexamer. To overcome insolubility of 2C, we will use Nanodiscs technique to plant full-length 2C hexamer on phospholipid bilayer. We use cryo-EM technique to determine high-resolution structure of Nanodiscs-2C hexamer and the structures in complex with ATP and RNA substrate. These structural information will reveal structural basis for 2C hexamer assembling, the concerted work of multiple subunits in hydrolyzing ATP and the unwinding of replication intermediate (dsRNA). The current project is the continuation of our previous research on 2C. Using the crystal structure of the soluble EV71-2C fragment to assist the determination of Cryo-EM structure of full-length 2C hexamer can reduce the complexity of structure determination. The applicant has long-term experience on structural and functional studies of enterovirus replicases, the technical platform for structural and virological studies are well established. Our institute is equipped with electron microscope suitable for Cryo-EM study.

申请人在前期工作中已成功解析了Picornavirus首个2C解旋酶结构"移除N端膜结合区的EV71-2C晶体结构"。我们发现，全长2C六聚体的组装是2C具有活性和EV71复制的必要条件；六聚体的形成依赖N-端膜结合区。为深入理解2C在EV71复制中的作用，我们拟研究全长2C六聚体的天然构象。为了克服2C不可溶问题，我们拟利用Nanodiscs技术，将全长2C六聚体植入磷脂双层上；利用冷冻电镜技术分别解析Nanodiscs-2C六聚体及其与ATP和RNA等形成复合物的高分辨结构。这些结构信息将揭示2C六聚体组装、亚基间协同完成ATP水解及解旋复制中间体-RNA双螺旋等的结构基础。本项目是前期工作的延续，基础扎实。用已知2C可溶片段的结构辅助完整六聚体电镜结构解析可显著降低技术难度。申请人具备多年肠道病毒复制酶结构与功能研究经验，技术平台成熟。依托单位已购置冷冻电镜，可支持本项目实施。

本项目的研究工作计划已基本执行完成，研究目标基本完成，相关研究成果在发表研究论文 “Crystal structure of a soluble fragment of poliovirus 2CATPase （PLoS Pathog. 2018 Sep 19;14(9):e1007304，标注本课题批准号）。其他成果还包括，Nat Commun. 2021; 12: 2843.，Acta Pharm Sin B. 2021 Jan;11(1):237-245.等，均标注了批准号）.肠道病毒感染引起细胞膜组分变构，在膜表面组装转录复制核心RO，合成病毒RNA基因组。肠道病毒2C是引起膜结构变构、参与RNA复制的关键蛋白质。我们围绕2C蛋白展开一系列研究，主要成果包括（1）我们在上一个国自然2C系列项目资助下（81572005），解析了首个肠道病毒属的首个2C解结构，EV71 2C结构；进而，我们在本项目资助下解析了PV 2C结构；PV 2C包含了ATP酶结构域，zinc-finger及C端alpha螺旋；PV 2C通过C端自我多聚；据此，我们提出了干扰2C-2C互作是潜在的抗病毒新策略。我们将多种2C抑制剂作用位点、耐药位点定位在2C六聚体模型上，为揭示耐药机制，辅助药物设计提供了重要依据。（2）我们发现FMDV 2C在细胞中定位在脂滴表面，诱导脂滴在细胞核附近发生群聚，解析了FMDV 2C晶体结构，相关研究成果在Cell Reports修回，标注了本课题号。（3）我们利用冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET），观察到FMDV 2C在脂滴膜表面发生聚集的精细结构，目前正在进一步提高电镜图像的分辨率。.在国自然基金持续资助下，我们在2C研究领域研究保持了引领地位，受到国际同行专家的关注。我们解析了PV 2C高分辨率结构，突破领域内十余年的难点。PLOS Pathogen杂志官方网站将我们发表的论文置于页眉位置进行展示。我们应邀参与撰写了爱思唯尔集团出版的酶学研究进展权威书籍《The ENZYMES》-Viral Replication Enzymes and their Inhibitors Part A。受邀撰写该书籍的作者均为国际病毒复制酶领域具有引领作用的科学家，这充分体现了2C系列研究在国际学界的引领地位。