枯草杆菌RecQ解旋酶结构与功能的研究

RecQ解旋酶是机体分子代谢途径中重要的调控蛋白。人体中某些RecQ酶缺失会引起疾病发生。本课题以枯草杆菌RecQ解旋酶为研究对象，研究其蛋白结构与酶生化活性的相互关系，以揭示RecQ解旋酶的分子运作机制。本实验室前期工作发现枯草杆菌具有两种异构体，在氨基酸序列上与其他RecQ酶家族成员具有较高的同源性，但却表现出不同的生化活性。缺失C端蛋白结构域的枯草杆菌RecQ，只能解开简单的DNA双链结构。具有完整结构的枯草杆菌RecQ能破坏DNA复制中典型的错误结构，同时在DNA修复中具有重要作用。其次蛋白结构分析表明，两者异构体都具有锌指结构，负责酶与DNA结合作用。随后本课题将采用放射性技术、荧光检测技术等解析HRDC结构域、精氨酸指结构在RecQ解旋酶生化活性中的作用,力求发现解旋酶结构与其功能的内在关联。同时构建RecQ敲除枯草杆菌菌株，探究RecQ调控细胞生长和DNA修复的分子机制。

通过pET原核表达系统，体外表达枯草杆菌RecQ解旋酶两种异构体：B.subtilis RecQL, B.subtilis RecQS，及其锌指结构、精氨酸指结构与HRDC结构相关突变体蛋白。通过His亲和层析及分子筛，纯化各种目的蛋白。荧光偏振技术、ATPase检测技术、EMSA方法和基于FRET原理的荧光光谱法等方法用于检测野生型与突变体蛋白的各种酶活性。实验结果证实：（1）B.subtilis RecQL, B.subtilis RecQS具有典型的RecQ酶活性，表现出DNA依赖性的ATP水解活性，浓度依赖的DNA结合、解旋活性。具有非ATP依赖性、时间和浓度依赖性的DNA退火活性。（2）B.subtilis RecQS 天然缺失C端的HRDC结构域，其各种酶活性表现均低于B.subtilis RecQSL。实验结果证实HRDC结构域负责B.subtilis RecQ酶对DNA的结合作用，从而促进酶对ATP的水解活性和对DNA的解旋作用，但其不影响酶对DNA的退火活性。（3）氨基酸序列比对与蛋白空间结构分析结果显示B.subtilis RecQL与B.subtilis RecQS都具有锌指结构域。各种酶活检测结果揭示，此功能区域在B.subtilisRecQ酶中不仅负责对DNA的结合作用，而且还有助于促进酶对ATP的水解、DNA的解旋和退火活性。实验发现锌指结构对B.subtilis RecQ的正确空间折叠也具有十分重要的作用。（4）B.subtilis RecQL的R320与R323，B.subtilis RecQS的R319与R322均参与酶对ATP的水解活性，其中B.subtilis RecQL R323与B.subtilis RecQS R322为B.subtili RecQ酶的精氨酸指结构，负责酶对ATP的结合作用，从而辅助酶对ATP的水解活性，帮助进一步对DNA的解链作用。但这些精氨酸残基均不参与RecQ酶对DNA结合作用和退火活性。以上结果表明，锌指结构、精氨酸指与HRDC结构负责RecQ酶不同的酶活性，与它们在其他RecQ家族成员之间的分子作用机制有一定的差异，它们协同完成酶对底物ATP、DNA的分子作用机制。