新型腈还原酶的资源挖掘及构效关系研究

This research describes the use of a highly specific and efficient genome mining approach to discover novel nitrile reductases with new structure and functional diversity from GenBank database. Studies on the structure-function relationship of nitrile reductase will be performed by homology modeling using the crystal structures of nitrile reductases deposited in Protein Data Bank as templates, followed by molecular docking, molecular dynamic simulation and protein engineering, aiming to widen its substrate scope. This work will add value to the current enzymology theory and its application area, and a green and efficient bienzymatic catalyzed process could be developed for the asymmetric synthesis of optically pure phenylethanolamines, a class of important intermediates in the synthesis of a variety of pharmaceutically important compounds.

本项目采用更加具有针对性和时效性的基因组挖掘手段，以文献报道的腈还原酶基因序列作为模板，在数量庞大的基因组数据库中挖掘结构新颖与功能多样的新型腈还原酶编码基因，并利用已解析的腈还原酶晶体结构对所获得的新型腈还原酶进行同源建模，通过分子对接、分子动力学模拟和蛋白质改造等手段解析腈还原酶对底物的识别/作用机制，为拓展酶的催化底物谱提供理论指导。项目研究成果可以丰富现有的酶学知识和应用范围，并可望用于建立高效的羟腈裂解酶-腈还原酶偶联催化体系由苯甲醛与氰化物一步直接合成光学纯苯乙醇胺等重要医药中间体。

腈还原酶是一类最近刚被发现的能够将腈化物直接还原为胺的新型生物催化剂，该酶的发现被认为是有望替代传统的化学催化还原腈化物为胺的有效途径。然而，自从该酶发现后已经过去了十二年，有关其在有机合成领域的应用却仍然是一篇空白。主要原因在于这类酶的底物谱非常窄，仅能够催化天然底物反应，而且其活性口袋周围的氨基酸十分保守，截止目前，任何通过蛋白质工程来提高其催化活力的尝试均以失败而告终。为了获得更加高效的新型腈还原酶，本项目通过基因挖掘的策略构建了一个包含16种腈还原酶的实体酶资源库，通过功能筛选和性能表征获得一个新型腈还原酶PcNRed，其比活力达到了354 U/g，是文献报道最高纪录的2倍。为了进一步提高PcNRed的催化效率，我们对其活性口袋周围的氨基酸进行分子改造，成功地将其催化活力由354 U/g提高至526 U/g，同时其温度稳定性也获得了2倍左右的提高。这是首次成功地通过蛋白质分子改造提高腈还原酶催化效率的报道。为了深入理解腈还原酶催化效率提高的分子机制，我们对腈还原酶进行同源建模和分子模拟，从蛋白质三维结构模型的角度来解释腈还原酶构效关系的变化。这些研究结果将为后续对腈还原酶进行分子改造进一步提高其催化效率甚至拓宽其底物谱奠定坚实的理论基础，同时相关的技术手段和研究方法也将为其他酶的分子改造提供借鉴。