膜锚定状态Rab11的构象变化与功能关系研究

Chronic diseases such as diabetes and cancer have become major threats to the Chinese public health. The occurrence and development of these diseases are mediated by the vesicle trafficking, which regulates the cellular surface expression of the receptor and adhesion molecules. Small monomeric GTPases 11 (Rab11) is one of the key molecules to regulate these processes via the recycling of endosomes. Rab11 undergoes prenylation and anchored on the membrane for its functional activity. As a result of the heterogeneity and instability of the conventional membrane mimicking system, the membrane anchored state has quite limited structural and biochemical study. This study will take advantage of the stability and homogeneity of the newly developed technology nanodiscs. Rab11 will covalently attach to the lipid moiety in vitro and attach on the nanodiscs, therefore mimicking the post-translational modification in vitro. NMR will be applied to investigate the conformational exchange upon membrane anchor. The important residues responsible for the conformation exchange upon membrane anchor will be mutated and investigated in the mammalian cells in order to link the structural conformation exchange and its cellular function. This study will improve the Rab11 dependent vesicle trafficking theory and provide novel targets for the therapeutic invention.

随着我国进入人口老龄化，癌症、糖尿病等慢性病已经成为我国居民的主要死因。这些疾病的发生发展与囊泡运输及其介导的受体和粘连分子的细胞表面分布有关，小G蛋白11（Rab11）正是调控这一过程的关键蛋白之一，因此对Rab11活性调控的研究至关重要。Rab11碳末端的异戊二烯化修饰影响其膜锚定状态，而这一状态是Rab11发挥功能的必要条件之一。但是由于体外类膜环境的不均一性和不稳定性，难以进行相关生物化学及结构生物学研究，目前对其膜锚定状态下的构象变化知之甚少。本项目拟结合近年发展起来的纳米磷脂盘技术，将Rab11的碳末端与磷脂偶联并锚定在磷脂膜上，通过核磁共振等技术研究膜锚定状态下影响Rab11构象和功能的重要位点及其对Rab11解离常数的影响。进而结合定点突变技术，在细胞内验证这些位点对其定位和生理功能的影响，以此完善Rab11依赖的囊泡运输的调控机制，为防治Rab11相关的疾病提供理论依据。

囊泡运输与癌症、糖尿病等慢性病的发生发展有关，而小G蛋白11（Rab11）是调控囊泡运输的关键蛋白之一。本项目通过综合多种生物物理技术、化学标记和生物化学方法，例如基因组测序分析、磁共振技术、X射线晶体衍射技术、分子动力学模拟、化学可逆偶联技术和纳米磷脂盘等技术研究了膜蛋白在细胞膜上的功能、构象变化、相互作用以及在细胞内的定位和转运功能。本研究发现了14个与肝癌、乳腺癌、胃癌等癌症相关的Rab11突变位点。其中，G2D、F12C、R33Q、Q70P、R72Q和E103D突变对Rab11的GDP和GTP结合有显著影响。G2D突变主要结合GTP，其在细胞内定位与GTP的主要结合形式Q70L相似。F12C、R33Q、Q70P、R72Q和E103D主要结合GDP，无法完成与GTP的交换，这5个突变在细胞内的定位与主要结合GDP的S25N突变类似，它们对Rab11的经典转运模型蛋白—转铁蛋白的转运功能影响显著。通过蛋白质结构解析和分子动力学模拟分析发现：突变后的Rab11GDP结合口袋较为松散。对500ns的动力学模拟数据统计发现，GDP结合状态和GTP结合状态空间分布较为离散。这一现象表明其GDP/GTP交换功能减弱，其结果与生物化学和细胞生物学实验结论一致。该分子动力学模拟方法有望进一步推广，作为区分单一突变对Rab家族GDP/GTP结合能力的筛选方法。本项目还开发了新型的蛋白质可逆化学偶联方法，TCEP可以将偶联的蛋白质快速解离下来。将Rab11的碳末端与磷脂偶联并锚定在磷脂膜上后，通过GDP/GTP交换实验发现，膜锚定对于蛋白质的活性影响不大，但是密度梯度离心表明膜上蛋白质局部浓度增大，可以增强与弱相互作用蛋白的相互作用。纳米磷脂盘稳定的膜蛋白被成功应用于针对生理状态下膜蛋白的功能性抗体的筛选。本研究发现了与癌症相关的新型Rab11突变形式，以及不同突变对于蛋白质结合小分子配体的影响及其对囊泡转运功能的影响。研究过程中开发的新型化学偶联方法和针对膜蛋白的抗体筛选模型具有一定的推广价值和应用前景。标注受本项目资助SCIE论文6篇，2篇在投稿中；培养研究生3人，目前1人毕业，2人博士在读。