特异性结构域突变的Rab11转基因与野生型Rab11的功能差异分析

We propose a functional study of a specific effector-binding domain of Rab11. Rab family of GTPases play key roles in regulating membrane trafficking. The emerging view is that each Rab recruits a unique set of four different effectors (EI-EIV) in mediating membrane trafficking. Due to the limitations of using dominant negative or constitutively active Rabs as mutant alleles, an effector-binding domain of a certain Rab can not be studied independently. While in Drosophila, we can use an existing rab11 null allele and a rab11 transgene with a mutated effector-binding domain to study the functions of this domain, and further develope a strategy to investigate the relationship between the structure and the function of a Rab. Initial study showed Rab11's amino acid residues 38-42 are involved in binding to one of its effectors, dRip11. We plan to construct a Rab11-38/42 transgene which has Rab11's 38-42 domain mutated and test whether it can rescue the rab11 null mutation phenotypes. By using the Rab11 wild-type transgene as a control, we will study the differences between these two transgenes in known Rab11 important functions such as stem cell maintenance, cell polarization, and tumor-like growth suppression.

本项目将尝试对Rab11亚家族的特异性的结构域展开功能研究。Rab GTPase家族在膜转运中起重要的调节作用。目前的模型提示每个Rab结合独特的一组四个效应蛋白来完成其膜转运功能，但某个Rab如何通过与其效应蛋白的结合来实现其功能特异性尚不清楚。而对Rab家族的研究多使用显性失活或组成活性的Rab作为突变，无法单独研究Rab某个特定的效应蛋白结合域。在果蝇中，可以利用已有的rab11无效突变，引入某个结构域突变的Rab11转基因来对这个结构域进行功能研究，进而探索研究Rab家族结构和功能关系的策略。前期试验发现Rab11的38至42号氨基酸残基在与其效应蛋白dRip11的结合中起作用。我们将构建该结构域突变的Rab11-38/42转基因，来对rab11无效突变进行拯救，并以野生型Rab11作为对照，分析两者在干细胞维持、细胞极化和类肿瘤生长抑制等已知的Rab11重要生物功能中的作用差异。

为了对Rab的效应蛋白结合域进行鉴定和功能研究来帮助解释某个Rab如何在膜转运过程中实现其特异性，以及Rab调控的膜转运过程在正常生物功能和病变中的机理，项目计划在果蝇中，利用已有的rab11无效突变，再以P因子介导的转座引入一个特定结构域突变了的rab11转基因进行拯救实验，从而揭示这个结构域在Rab生物功能中的独特作用。同时我们也计划使用attP位点的定点定位整合方法作为备选方案。CRISPR技术的快速发展，要求我们改变原计划的实验方案，在基因组中直接编辑rab11原位基因（endogenous gene），以回避位置效应。我们因此在开展对rab11基因研究的同时，开展了对CRISPR技术本身的研究。.我们发现rab11-38/42突变可以拯救Oskar定位，但不能抑制类肿瘤生长。我们还发现dRip11基因，一个结合rab11这个结构域的功能蛋白，与rab11基因在border cell这一迁移细胞模型中具有功能相关性。在方法学方面，我们开发了基于CRISPR的高效果蝇基因组突变技术，发展了使用Cas9 nickase的DNA编辑技术，还对这些技术的效率以及特异性开展了研究。.实验结果显示，rab11的功能特异性来自于其表面效应蛋白结合结构域，提示rab亚家族蛋白的功能差异来自于与这些小结构域结合的效应蛋白。但是，这些效应蛋白突变并不能完全重演rab11突变的表型，暗示我们对rab亚家族效应蛋白的寻找还并未穷尽。而本项目中产生的突变品系，以及制造这些品系的方法，可以帮助我们搜寻鉴定更多的效应蛋白并确定他们的功能。而且，我们开发的一整套果蝇基因组编辑的解决方案应用前景广阔，对以果蝇为模式生物开展的遗传和发育生物学研究方式可能产生重大影响。