NMDA受体蛋白在氧化-还原状态下的构象变化

NMDA receptor, as ionotropic glutamate receptor, plays an important role in physiological and pathological processes such as learning, memory and brain injury. Studies have indicated that permeability of NMDA receptor for ions changes upon redox modulation, possibly associated with formation/cleavage of disulfide bonds in ligand binding domain (LBD). The dynamic process for LBD binding to the ligand is essential for ion current regulation, however, it is still not clear how this process is influenced by redox moduation. In this study, we will combine Paramegnetic Relaxation Enhancement (PRE) NMR technique and Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy to investigate (1) conformation and dynamics of NMDA-LBD in both apo (ligand-free) and holo (bound to full agonist, partial agonist or antiagonist) states; (2) the effect of redox modulation on conformational and dynamical fluctuation of NMDA-LBD. Results from this work will be able to provide a greater understanding of the function and regulation mechanism of NMDA receptor, as will guide the more precise regulation of the receptor as well as pharmacology research on relevant diseases.

NMDA受体是离子型谷氨酸受体，参与学习记忆、脑损伤等重要生理病理过程。研究显示NMDA受体在氧化或还原状态下对离子的通透性明显不同，可能与其配体结合域（LBD）二硫键的形成和断裂有关。LBD结合配体后的动态变化是调控离子电流的关键，但氧化-还原对LBD的动态过程有何影响，目前尚不清楚。本研究拟采用顺磁弛豫增强的核磁共振技术，结合电子顺磁共振技术，通过研究：（1）NMDA-LBD在自由状态（apo）以及与不同的配体（包括完全激动剂、部分激动剂和拮抗剂）结合时（holo）的蛋白构象和动态过程；（2）氧化-还原两个状态下，比较NMDA-LBD的apo和holo蛋白构象和动态过程的差异。最终阐明氧化-还原对NMDA-LBD动态过程的影响，为NMDA受体的功能变化、配体对其调节的机制研究提供动态结构上的信息，从而为更加精准的调节NMDA受体，为NMDA受体靶向型的药物研究提供依据。

NMDA受体是离子型谷氨酸受体，参与学习记忆、脑损伤等重要生理病理过程。研究显示NMDA受体在氧化或还原状态下对离子的通透性明显不同，可能与其配体结合域（LBD）二硫键的形成和断裂有关。LBD结合配体后的动态变化是调控离子电流的关键，但氧化-还原状态对LBD的动态过程有何影响，目前尚不清楚。我们成功的通过大肠杆菌体系在体外表达了NMDA受体NR1亚基的配体结合域蛋白，由于蛋白中含有7个巯基，容易在表达的过程中形成二硫键引起错误折叠，因此表达量很低。我们通过大体积培养和低温表达等方法，大大提高了蛋白的表达产量。为了避免在顺磁标记的过程中引入更多的半胱氨酸残基，我们研发了一种新型的Cu2+刚性顺磁探针，通过连接组氨酸来标记蛋白位点。同时，我们还发展了化学交联结合质谱分析的方法来研究受体蛋白的四级结构，借助于质谱法的高灵敏度，用样品量少，以求摆脱蛋白产量低的制约。我们利用Cu2+的可还原性研发了新的测定抗氧化性和定量巯基的电子顺磁共振方法，用来帮助理解蛋白中巯基的氧化-还原状态。