柔肝方通过调控浆样树突状细胞介导Th22细胞分化抗肝纤维化的作用机制研究

Rougan Formula is the anti hepatic fibrosis valid prescription with the restoring deficiency and dissolving blood stasis treatment. Many studies have shown that plasmacytoid dendritic cells (pDCs) secrete IL-6, TNF-α, IL-23 to promote T helper cell 22 (Th22) secrete IL-22, which is known to play a key role in promoting antimicrobial immunity. IL-22 induces the senescence of HSCs by activating the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), which express both IL-10R2 and IL-22R1, there by ameliorating liver fibrogenesis. Thus we hypothesized: Rougan Formula can be raised pDCs secrete IL-6, TNF-α, IL-23, promote Th22 secreted IL-22, induces the senescence of HSCs to anti hepatic fibrosis. ConA induced murine model for hepatic fibrosis is used in this study, and the effects of Rougan formula on the IL-6, TNF-α, IL-23 expressions of pDCs, the IL-22 expressions of Th22, and the IL-10R2/IL-22R1 , α-SMA, MMPs, p53 expressions of HSCs. Study the mechanism of Rougan formula to regular the peripheral blood pDCs mediated Th22 differentiation and secretion of IL-22; Further study the mechanism of Rougan formula to Th22 mediated HSCs senescence and JAK-STAT pathway activation ,to interpret the immunologic mechanism of Rougan formula anti hepatic fibrosis.

柔肝方是以补虚化瘀为主治疗肝纤维化（HF）的有效方剂，可抑制肝星状细胞（HSC）活化。研究表明浆样树突细胞（pDCs）分泌IL-6、TNF-α、IL-23促进辅助性T细胞22（Th22）分泌IL-22，与IL-10R2/IL-22R1结合激活JAK-STAT通路介导HSC凋亡。由此提出假说：柔肝方可上调pDCs分泌IL-6、TNF-α、IL-23，促进Th22分泌IL-22，介导HSC凋亡抗HF作用。建立Con A肝纤维化模型，观察从炎症到纤维化过程中柔肝方对肝脏pDCs分泌IL-6 、TNF-α、IL-23，Th22分泌IL-22，HSC表达IL-10R2/IL-22R1、α-SMA、MMPs、p53及其抗HF疗效相关性；研究柔肝方对外周血pDCs介导Th22分化和分泌IL-22的影响；进一步探讨柔肝方对Th22介导HSC凋亡及JAK-STAT通路的影响，为柔肝方抗HF提供部分免疫机制。

肝纤维化是由于细胞外基质的合成、降解失衡导致在肝内过量沉积。肝星状细胞（HSC）激活机制及抑制活化途径的研究和发现成为防治肝纤维化的关键。中医药可逆转肝纤维化已被国内外学术界广泛认可。柔肝方是上海市名中医王灵台教授根据补虚化瘀法论治肝纤维化理论研发的曙光医院中药院内制剂，具有较好的疗效。本项目建立Con A诱导的肝纤维化小鼠模型，研究发现：1）柔肝方可将降低Con A诱导的肝纤维化小鼠模型血清中的ALT、AST水平，显著改善肝脏纤维化程度。2）柔肝方可提高小鼠肝脏单个核细胞中IL-6、TNF-α基因和蛋白表达水平，对IL-23、IL-22基因和蛋白表达水平有一定的促进作用，表明柔肝方抗肝纤维化的主要作用机制可能为促进pDCs分泌功能，诱导了Th22分化。3）柔肝方可降低肝纤维化小鼠肝脏中的α-SMA蛋白表达水平，提高MMP13蛋白表达水平，表明柔肝方可降低HSC活化水平，诱导其凋亡。体外应用免疫磁珠分离健康人外周血pDCs和初始CD4+ T细胞，应用Boyden小室共培养，研究发现：1）柔肝方药物血清可上调健康人外周血pDCs的IL-6、TNF-α基因和蛋白表达水平；2）柔肝方药物血清可促进Th22分化数量，上调Th22的IL-22基因和蛋白表达水平；3）混合淋巴细胞反应表明柔肝方药物血清可促进pDCs分泌IL-6、TNF-α、IL-23水平，并显著增高Th22分泌IL-22水平，表明柔肝方可通过促进pDCs分泌相关细胞因子水平介导Th22分化；4）柔肝方药物血清可促进人HSC细胞的IL-22R1和MMP13基因和蛋白表达水平，降低α-SMA蛋白表达；5）柔肝方药物血清可促进人HSC细胞的JAK- STAT3的磷酸化水平，表明柔肝方调控HSC凋亡与JAK-STAT3信号分子相关。本项目初步明确了柔肝方作为抗肝纤维化有效方剂的部分作用机制，为中医药逆转肝纤维化提供了科学依据。