产硫化氢酶HapE蛋白在肺炎支原体致病中的作用及其功能研究

Mycoplasma pneumoniae (Mp) is a common cause of community-acquired pneumonia in children. It can cause multiple system complications. HapE is a novel potential virulence factor of Mp, and it showed enzymatic activity that can produce hydrogen sulfide which responsible for hemolysis caused by Mp. However, the pathogenic mechanism and antioxidant mechanism of HapE protein is still not clear. Based on previous studies on Mp other pathogenic mechanism, in this study, we will use western blotting assay and immunofluorescence electron microscope to observe its subcellular localization; construct the Mp strain without HapE gene, by observing the strain morphology and cell toxicity, to identify its impact on Mp biological character; use HapE monoclonal antibody and hydrogen sulfide inhibitor to stop the process of Mp infect HBE cell to identify the effects of HapE virulence of Mp; By adopting the Real time-PCR method and antibiotics pressure test to investigate the relationship between the HapE protein and oxidative stress, and confirme that it has the function of antioxidant and participate in Mp immune escape. The study will benefit to reveal the host cell damage by Mp infected and the mechanism of action of the whole body system more complications; it can provide a new insight to the treatment targets of Mp infection.

HapE蛋白是在肺炎支原体（Mp）内最新发现的一种半胱氨酸脱硫酶，体外研究初步表明HapE蛋白能催化产生硫化氢引起红细胞裂解，但该酶是否还具有其他的毒性作用尚不清楚；以往的研究表明内源性硫化氢与宿主损伤及氧化应激密切相关，HapE蛋白是否也具有抗氧化损伤、参与Mp免疫逃逸目前尚不明确。本研究拟采用基因克隆等手段获取重组HapE蛋白，通过Western blotting和免疫荧光-激光扫描共聚焦显微技术分析HapE定位情况，阐明HapE定位对其功能的影响；同时采用同源重组方法构建HapE功能缺失菌株，通过组间比较观察其对人呼吸道上皮细胞的毒性作用；并通过抗体阻断实验、硫化氢抑制实验及RT-PCR、抗生素压力试验等方法探讨HapE与氧化胁迫的关系，以证实其在Mp抗氧化损伤中的作用。本课题的完成有利于进一步丰富HapE的致病机制和Mp抗氧化损伤的免疫逃逸机制，为Mp的治疗靶点开辟新的途径。

肺炎支原体是社区获得性肺炎（Mp）的重要致病菌。Mp的HapE蛋白是新发现的一种毒力因子，以往的研究仅显示HapE蛋白可催化半胱氨酸产生硫化氢引起红细胞裂解，但该蛋白是否还具有其他的毒理作用尚不清楚；本项目选择以下几个方面作为主要研究内容和方向（1）HapE蛋白的表达、纯化、抗体制备及细胞定位；（2）HapE蛋白的细胞毒性试验及抗体和硫化氢抑制剂对阻断HapE蛋白细胞毒性的影响；（3）HapE蛋白的抗氧化能力和对DNA的保护作用研究。研究结果证实了①HapE蛋白在细胞中的定位，除了细胞核外，在细胞质和细胞膜中均有表达。②HapE蛋白可引起细胞凋亡和细胞增殖抑制，且呈剂量依赖性。③HapE蛋白可阻断细胞S期向G2期的进程，阻止细胞的有丝分裂，可能与感染肺炎支原体后细胞凋亡增加有关。④HapE蛋白可影响人正常呼吸道上皮细胞细胞因子的分泌，可同时促进部分抗炎因子和促炎因子的分泌，具有双向作用，与肺炎支原体引起的炎症反应（大部分为轻症且具有自限性，症状持续时间长）有关。⑤HapE蛋白可影响人正常呼吸道细胞的自噬作用，减弱其自噬效果，使感染肺炎支原体的细胞难以发生自噬，从而降低细胞清除病原体的作用，使肺炎支原体在细胞内得以长期存活，与肺炎支原体感染人体后可引起长期的呼吸道反应（主要是咳嗽）有关。⑥HapE蛋白的DNA结合能力比较弱，对菌株DNA的保护作用不明显，其抗氧化能力有限。本课题的完成有利于进一步丰富HapE的致病机制和Mp抗氧化损伤的免疫逃逸机制，为Mp的治疗靶点开辟新的途径。