红曲菌桔霉素pksCT基因前体mRNA的选择性剪接调控其生物合成的分子机制

Monascus spp. are the strains which used to produce traditional fermentation food “Hongqu” in China, but some strains can synthetize citrinin and affect the safety of “Hongqu”. In our previous research, we found that the pre-mRNA of citrinin polyketide synthase gene pksCT can produce two kinds of mRNA (pksCTα and pksCTβ) through alternative splicing (AS) to regulate the yield of citrinin, but the mechanism is unclear so far. In this project, the reverse double promoters RNA interference vector will be constructed. Then three kinds of RNA interference Monascus mutants including separate and simultaneous interference of pksCTα and pksCTβ will be constructed. In these mutants, the expression level of pksCTα and pksCTβ, expression differences of corresponding proteins and biosynthesis of citrinin and its intermediates will be detected. Moreover, the degradation level of pksCTα and pksCTβ by nonsense-mediated mRNA decay pathway in Monascus will be analysed. Thus the effect of AS for citrinin synthesis can be resolved from mRNA, protein and metabolites levels, which will clarify the mechanism that used by Monascus strains to regulate citrinin biosynthesis through AS. These researches will lay foundation for efficient controlling or reducing the production of citrinin in Monascus spp. and enrich the modulation theory of fungal secondary metabolites.

红曲菌（Monascus spp.）是我国传统发酵食品红曲的生产菌种，但部分菌株产生真菌毒素桔霉素影响其安全性。申请人前期研究发现桔霉素聚酮合酶基因pksCT前体mRNA可通过选择性剪接（alternative splicing，AS）产生两种mRNA（pksCTα和pksCTβ）来调控桔霉素合成量，但机理不清楚。本项目拟构建反向双启动子RNAi载体，基于此构建单独或同时干扰pksCTα和pksCTβ表达的3类RNAi突变红曲菌，检测突变菌中这两种mRNA表达变化、蛋白质表达差异及合成桔霉素和中间代谢产物情况，并分析红曲菌中无义介导mRNA降解途径对pksCTα和pksCTβ降解情况。从mRNA、蛋白质和代谢产物三个水平综合解析AS对桔霉素合成影响，阐明红曲菌利用AS调控桔霉素生物合成的分子机制。研究结果不仅为有效控制或消除红曲菌桔霉素的合成提供理论指导，也可丰富真菌次级代谢产物调控机制。

红曲菌（Monascus spp.）是我国传统发酵食品红曲的生产菌种，但部分菌株产生真菌毒素桔霉素影响其安全性。项目组前期研究发现桔霉素聚酮合酶基因pksCT前体mRNA可通过选择性剪接（alternative splicing，AS）产生两种mRNA（pksCTα和pksCTβ）来调控桔霉素合成量。本项目研究发现放线菌酮的添加会对桔霉素pksCT基因的表达有明显的抑制作用，pksCTα与 pksCTβ表达量的比例先上升后下降，且与桔霉素的合成量的增减趋势成一致性。本项目开发了反向双启动子RNA干扰技术及配套的高通量筛选RNA干扰菌株的方法，利用该方法分别构建了干扰pksCTα及同时干扰pksCTα和pksCTβ的反向双启动子和发夹结构RNA干扰突变菌株，其桔霉素产量降低了67.9-94.4%，但是基本不影响红曲色素产量、红曲菌生长速度和分生孢子产量。进一步分析发现，干扰pksCTα突变菌株中，醛酮变位酶、短链脱氢酶、葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶等蛋白的基因表达量显著增加，烯酰-酰基载体蛋白还原酶的基因表达量显著减少。而同时干扰pksCTα和pksCTβ的突变菌株中，醛酮变位酶、短链脱氢酶、碳酸酐酶和烯酰-酰基载体蛋白还原酶的基因表达量显著增加。GO和KEGG 通路分析表明类固醇的生物合成通路和氧化磷酸化通路两个通路是造成单独干扰pksCTα样本组和同时干扰pksCTα与pksCTβ样本组中桔霉素合成量的差异的重要因素。研究结果解释了红曲菌利用AS调控桔霉素合成的分子基础，同时为利用RNA干扰技术大幅度降低红曲菌中桔霉素产量，从而提高红曲产品的安全性奠定了理论基础。