海带致病菌鞭毛蛋白N端序列多态性与其诱导的免疫防御反应相关性研究

Flg22, which is a 22 amino acid peptide spanning the most conserved domain derived from the N terminus of flagellin, has been identified as an active elicitor of immunity defense response in higher plants. Identification of flg22 receptor in Arabidopsis thaliana makes a great progress in signaling pathway of defense response. However, N terminal sequence of algal pathogenic bacteria and its elicitor activity in algae are still poorly understood. Therefore, the proposed project aims at 4 research contents: (1) cloning and sequencing analysis of flagellin genes of pathogenic bacteria of Saccharina japonica; (2) expression and purification of flagellin; (3) investigating immunity defense response triggered by flagellins and their flg22 through detecting the release of H2O2, cytological observation of ROS as well as growth inhibition; (4) through the construction of flg22-derived peptide library, identifying the relationship between the structure of flg22 and its elicitor activity. Our findings will decipher the N terminal sequence polymorphism of flagellin of S.japonica pathogenic bacteria and its correlation on elicitation of immunity defense response. Furthermore, the results will not only help to establish a new experimental model of interactions between pathogenic bacterial flagellin/flg22 – S. japonica, which will make up the lack of stable experimental model in this field currently, but also could lay an important foundation for further research in signaling pathways of immunity defense response in S. japonica.

细菌鞭毛蛋白N端高度保守的氨基酸多肽--flg22是诱导高等植物免疫防御反应的激发子。拟南芥中flg22受体的发现，使得防御反应信号传导途径的研究取得了突破性的进展。但关于藻类致病菌鞭毛蛋白N端的序列及其激发子活性的相关研究却高度匮乏。因此，本项目拟开展如下研究：（1）运用分子生物学方法克隆海带致病菌鞭毛蛋白基因并进行序列分析；（2）鞭毛蛋白的体外表达与纯化；（3）以H2O2、ROS及生长抑制为检测指标，研究鞭毛蛋白及其flg22诱导的海带免疫防御反应；（4）构建flg22衍生多肽文库，研究flg22的结构与其激发子活性的关系。根据上述研究结果，阐明海带致病菌鞭毛蛋白N端序列多态性与其诱导的防御反应的相关性。本研究结果不仅可构建新的、稳定的致病菌鞭毛蛋白/flg22 -- 海带互作实验模型，填补这一领域的空白，而且为深入研究海带免疫防御反应信号传导途径奠定重要的工作基础。

现已证实高等植物致病菌鞭毛蛋白N端高度保守的氨基酸多肽--flg22是诱导高等植物和海带免疫防御反应的激发子。本项目聚焦海带致病菌鞭毛蛋白N端序列多态性与其诱导的免疫防御反应相关性，主要研究结果如下：（1）运用分子生物学及基因组学方法分别获得了弧菌属与假交替单胞菌属海带致病菌与非致病菌鞭毛蛋白基因及其N端22个氨基酸多肽序列。发现不同属来源的致病菌与非致病菌flg22在N端第36位具有高度多态性；（2）实现了弧菌属致病菌鞭毛蛋白（FliCV63）的体外表达与纯化；（3）弧菌属致病菌flg22V63与FliCV63均可诱导海带产生H2O2、ROS以及生长抑制现象，说明flg22V63与FliCV63均是海带的有效激发子。但flg22V63的激发子活性高于FliCV63；（4）以flg22 V63衍生多肽为激发子，研究发现 flg22V63 N端第 43位点上的天冬氨酸是其作为海带激发子活性的活性位点，flg15V63是诱导海带幼孢子体产生免疫防御反应的最小抗原表位；（5）flg22诱导的海带防御反应转录组学分析表明：GO 富集的差异基因主要富集在参与生物过程中的刺激反应过程以及分子功能中的催化活性方面；KEGG富集的差异基因显著地富集在硫代谢和植物激素信号转导通路上，说明这些通路参与了flg22诱导的海带免疫防御反应过程。其中，抵抗外界刺激的相关基因在flg22诱导的高等植物转录组分析中也有发现，因此推测flg22诱导的免疫防御反应在高等植物和低等藻类中存在进化保守性。本项目首次研究了海带致病菌与非致病菌鞭毛蛋白N端氨基酸序列多态性及其对所诱导的海带免疫防御反应的影响。研究结果不仅构建了新的、稳定的致病菌鞭毛蛋白/flg22--海带互作实验模型，填补这一领域的空白，而且为深入研究海带免疫防御反应信号传导途径奠定重要的工作基础。