朊蛋白N 端与其构象转变的关系

The conformational conversion of the host normal prion protein (PrPC) to the pathogenic conformational isoform, PrPSc, is central to the pathogenesis of prion disease. Fro a long time, the N-terminal PrP had been thought to play little role in its pathogenic conformation conversion. However, recent experimental evidence clearly revealed that the N-terminal part of PrP, particularly the very N-terminal positively charged amino acid cluster, plays a critical role in its conversion to the pathogenic conformer. Thus far, it remains unclear how the N-terminal of PrP affects its conformation conversion. This application focuses on the following two key questions about the influence of PrP N-terminal on PrPC-to-PrPSc conversion. 1) Does the effect depend on the positive charges carried by the N-terminal amino acids or the special amino acid sequence? 2) Does the effect depend on the direct protein-protein interaction or an indirect cofactor-mediated interaction? Although the prion hypothesis has been supported by compelling experimental evidence, the molecular basis of PrPC-to-PrPSc conversion remains elusive. The study proposed in this application aims to gain knowledge about this central question in the pathogenic process of prion disease, which will potentially lead to novel prophylactic and therapeutic strategies against these fatal transmissible neurodegenerative disorders.

长久以来，朊蛋白的N 端被认为对其构象转变及致病性影响很小，其作用一 直被忽视。然而，最近的实验证据表明：朊蛋白的N 端，尤其是23-28 的碱性氨基酸在其 构象转变过程中起非常关键的作用。尽管如此，朊蛋白N 端是如何影响其构象转变的分子机 制依然未知。本项目将围绕朊蛋白的N 端在介导PrPC 至PrPSc 构象转变过程中的作用，阐 明以下两个关键问题：第一：该作用是依赖N 端碱性氨基酸所携带的正电荷还是依赖其特殊 的氨基酸顺序？第二，该作用是两个蛋白分子之间的直接结合，还是依赖辅助因子的间接 结合？根据 "Prion"学说，朊蛋白类疾病是因蛋白质构象转变引起的疾病。虽然该学说已 经基本被证实,但是，正常的朊蛋白PrPC 是如何通过构象转变而成为致命的朊病毒PrPSc 的 分子机理却仍然知之甚少。该项目的顺利完成，将有助于我们理解该类疾病发病机理的核心 问题，并为开发有效防治手段打下基础。

最近的实验证据表明：朊蛋白的 N 端在其构象转变过程中起非常关键的作用。尽管如此，朊蛋白 N 端是如何影响其构象转变的分子机制依然未知。本项目围绕朊蛋白的 N 端在介导 PrPC 至 PrPSc构象转变过程中的作用，阐明以下关键问题：该作用是依赖 N 端碱性氨基酸所携带的正电荷还是依赖其特殊的氨基酸顺序？.本项目构建了两种朊蛋白突变体，即N端6个氨基酸全删除的ΔN6和其中4个带正电荷的氨基酸被甲硫氨酸替代的Met4-1，从蛋白质错误构象循环扩增（sPMCA）实验和细胞孵育实验两个角度阐述N端23-28的氨基酸在朊蛋白构象转变中的作用。..本项目设计了如下三种PrP表达质粒：（1）PrP（Wild-type）；（2）PrP（ΔN6）；（3）PrP（Met4-1），我们分别连接原核表达质粒与真核表达质粒，从sPMCA及细胞层面两个水平对三种朊蛋白的构象转变能力进行分析。..在体外生化水平，我们纯化了野生型及两个突变体蛋白，与辅助因子配为相应底物，接种野生型朊病毒种子，利用sPMCA技术进行错构扩增，结果如下：（1）三种分子都具转变PrPSc的能力。（2）在同一野生型朊病毒Seed的最初诱导下Met4-1能稳定传代，而ΔN6传代能力将逐渐丧失。（3）18轮的传代能力WT显著高于Met4-1及ΔN6，而Met4-1也显著高于ΔN6。..在细胞水平，我们建立了表达野生型及两个突变体朊蛋白的稳定细胞系，利用野生型朊蛋白sPMCA产物诱导的致病小鼠脑匀浆进行细胞的感染实验，经蛋白酶K消化后的免疫荧光结果如下：（1）三种稳定细胞系都能被诱导转变为PrPSc。（2）RK13-WT及RK13-Met4-1的PrPSc阳性细胞率随细胞传代构象转变能力也能稳定维持，但RK13-ΔN6随细胞传代却逐步下降。（3）PrPSc阳性细胞率，RK13-WT显著高于RK13-Met4-1及RK13-ΔN6，而RK13-Met4-1和RK13-ΔN6在统计学分析上虽不显著，但其P值趋于显著。..总结：从以上两部分实验结果相互印证，说明：在PrP错误变构为PrPSc过程中，N端23-28位碱性氨基酸序列的正电荷及序列的完整性均参与了此过程，且起到稳定此过程的作用。