应用携带TC标签的猪瘟病毒研究Npro蛋白核定位分子机制

The N-termianl autoprotease Npro, which is unique to pestiviruses, is involved in prevention of type I interferon production by promoting proteasomal degradation of interferon regulatory factors 3 or 7. Previously, we demonstrated for the first time the nuclear localization of Npro in living cells using biarsenically labeled classical swine fever virus (CSFV). However, the molecular mechanism and function(s) of nuclear localization of Npro remain unclear. This proposal is aimed to 1) track the nuclear trafficking of Npro in living PK-15 cells infected with tetracysteine-tagged CSFV, 2) determine the nuclear import pathway of Npro using passive diffusion and selective translocation assays, 3) map the nuclear localization signal of Npro using serial deletion mutants of Npro tagged with enhance green fluorescent protein, 4) identify the cellular nucleoprotein(s) interacting with Npro by GST pull-down, co-immunoprecipitation, mammalian cell two-hybrid, co-localization and RNA interference assays, and 5) investigate the effects of cellular nucleoprotein(s) on Npro localization, type I interferon induction and viral replication by overexpression and knock-down. This project is expected to uncover the molecular mechanism of nuclear localization and new function(s) of Npro, and provide useful data for understanding of the replication and pathogenicity mechanisms of CSFV.

Npro蛋白是瘟病毒属成员特有的自体蛋白酶，具有拮抗宿主Ⅰ型干扰素产生的功能。此前我们通过猪瘟病毒标记和活细胞成像技术首次发现，Npro蛋白具有核定位现象，但Npro蛋白的核定位分子机制及其生物学功能目前尚不清楚。本项目拟利用插入TC分子标签的猪瘟病毒实时示踪Npro蛋白的入核过程；通过被动扩散、选择性易位试验确定Npro蛋白的入核方式；利用绿色荧光蛋白标记和截短表达界定Npro蛋白的核定位信号；通过 GST pull-down、免疫共沉淀、哺乳动物细胞双杂交、激光共聚焦、RNA干扰等技术筛选和鉴定与Npro蛋白相互作用的细胞核蛋白；通过上调和下调表达研究细胞核蛋白对Npro蛋白核定位、Ⅰ型干扰素应答和猪瘟病毒复制的影响，以及Npro蛋白对细胞核蛋白功能的影响，从而阐明Npro蛋白核定位的分子机制和生物学新功能，为揭示猪瘟病毒复制和致病机制提供科学数据。

本研究利用猪瘟病毒（CSFV）标记和活细胞成像技术首次发现Npro 蛋白具有核定位现象，但Npro 蛋白的核定位分子机制及其生物学功能目前尚不清楚，本项目进行了Npro蛋白的核定位机制，Npro与宿主蛋白相互作用及其功能的研究。.（一）猪瘟病毒Npro蛋白核定位机制.利用携带TC标签的CSFV动态示踪了Npro蛋白的核输入和输出的过程，研究发现在CSFV感染的27 h，Npro蛋白定位在细胞质中，而在病毒感染的48 h，Npro蛋白定位在细胞核内，在病毒感染的36.5-37 h，能够观测到Npro蛋白的核输入和核输出。.利用截短表达的Npro蛋白进行亚细胞定位分析，结果表明所有的截短突变体均能进入细胞核，从而说明Npro蛋白进入细胞核不依赖于核定位信号。另外，利用反向遗传操作构建了Npro携带IRF3的重组CSFV（rIRF3-CSFV），激光共聚焦显示Npro-IRF3融合蛋白不能进入细胞核，融合蛋白增大了Npro蛋白的分子量，表明Npro通过被动扩散进入细胞核。该重组病毒的一步生长曲线显著低于野生型病毒，动物试验结果表明rIRF3-CSFV病毒的对猪无致病性，并且能够抵抗致死性强毒株的攻击，表明该重组病毒是一个安全的潜在的疫苗候选株。..（二）猪瘟病毒Npro蛋白与宿主蛋白的相互作用及功能分析.利用酵母双杂交筛选获得了20种与Npro蛋白相互作用的宿主蛋白，通过GST pulldown、免疫共沉淀和共聚焦等试验进一步确认了Npro-PCBP1之间的相互作用，应用RNA干扰下调PK15细胞中PCBP1的表达明显地抑制CSFV的复制，而过表达PCBP1蛋白明显促进CSFV的复制，深入研究发现，PCBP1能明显抑制IFN-β信号通路，因此，CSFV通过Npro与宿主蛋白PCBP1的相互作用而拮抗IFN-β信号通路以利于病毒的复制。此外，探索了血红蛋白β亚基、硫氧还蛋白2、翻译延伸因子1A调控病毒复制的分子机制。..本项研究阐明Npro蛋白核定位的分子机制和生物学新功能，为开发猪瘟新型致弱疫苗奠定了基础，并为揭示猪瘟病毒复制和致病机制提供科学数据。