猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株调控干扰素应答差异的分子机制

There exist distinctive differences in the interferon (IFN) response regulated by highly virulent classical swine fever virus (CSFV) and C-strain, a lapinized attenuated vaccine against classical swine fever. However, the underlying molecular mechanisms remain unclear. Previously, we demonstrated that highly virulent CSFV Shimen strain and C-strain show differences in the interactions between major viral proteins (such as NS3 and E2) and innate immunity-related signalling molecules, resulting in differential modulation of the IFN response. This proposal is aimed to: 1) screen and identify viral proteins that are involved in the IFN response using luciferase reporters harboring innate immunity-related molecules; 2) investigate functional aspects of the identified viral proteins interacting with the molecules of innate immunity and the IFN signalling pathway by co-immunoprecipitation, GST pulldown, colocalization and luciferase reporter gene assays; 3) construct a series of chimeric viruses containing the corresponding region(s) of C-strain based on the Shimen strain backbone to map the key region(s) or site(s) responsible for the interactions between the identified viral proteins and innate immunity-related molecules in the IFN signalling pathway; 4) generate a series of chimeric viruses, in which the key region(s) or site(s) was mutated, and evaluate the IFN induction, viral replication, and pathogenicity of the chimeras in macrophages, dendritic cells and pigs. This project is expected to uncover the molecular mechanisms of the differential IFN response regulated by CSFV with different virulence, and provide scientific data for elucidating mechanisms underlying the attenuation of C-strain.

猪瘟病毒（CSFV）强毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株（C株）在调控干扰素（IFN）应答方面存在明显差异，其分子机制尚不明确。此前我们发现，CSFV强毒和弱毒编码蛋白（如NS3和E2）与天然免疫分子相互作用及其介导IFN的应答存在差异。基于此，本项目利用天然免疫相关分子荧光素酶报告系统高通量筛选和鉴定调控IFN应答差异的CSFV蛋白；通过免疫共沉淀、GST pulldown和荧光素酶活性试验等，确定病毒蛋白与天然免疫分子的相互作用及其对IFN信号通路的调控；通过构建病毒蛋白嵌合突变体和丙氨酸扫描，鉴定影响强毒和弱毒诱导IFN应答差异的关键区域或位点，进一步利用反向遗传操作平台构建突变体病毒，分别在细胞和动物水平比较CSFV突变体病毒、强毒及弱毒诱导IFN应答、病毒复制和致病性的差异。本项目可望揭示CSFV强毒和弱毒调控IFN应答差异的分子机制，并为阐明C株致弱机制提供科学数据。

猪瘟病毒（CSFV）强毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株（C株）在调控干扰素（IFN）应答方面存在差异，其分子机制尚不明确。项目组进行了CSFV强毒石门株和C株诱导IFN应答差异的病毒蛋白筛选，利用酵母双杂交筛选与其互作的宿主蛋白，以及进行CSFV石门株和C株感染PBMCs转录组分析，筛选差异的宿主信号通路和关键分子；在细胞水平上，进行了病毒与宿主蛋白互作及其调控病毒复制机制研究；在SPF猪体上，应用不同毒株的CSFV进行感染试验。1）天然免疫报告系统筛选CSFV强弱毒差异蛋白。.项目组利用双荧光素酶报告系统筛选了诱导天然免疫信号通路差异的CSFV基因编码蛋白，发现CSFV强弱毒的E2蛋白诱导的NF-κB信号通路存在差异，强毒株NS5B蛋白激活的IFN信号通路明显高于弱毒株NS5B蛋白；2）调控天然免疫差异的病毒蛋白与宿主蛋白互作分析。为探究E2蛋白在调控宿主天然免疫信号通路中的作用，利用酵母双杂交筛选与E2蛋白互作的宿主蛋白。通过免疫共沉淀等技术鉴定了宿主分子MEK2与E2蛋白存在相互作用，其互作关键区域位于E2的aa 890-1053和MEK2的aa 266-400。CSFV感染诱导了MEK2/ERK信号级联反应呈现双时相变化，应用MEK2特异性抑制剂U0126处理细胞明显抑制了CSFV的复制。此外，发现MEK2正调控CSFV的复制，利用JAK-STAT通路抑制剂Ruxo处理后，发现MEK2负调控IFN诱导的JAK-STAT通路促进病毒复制。3）CSFV强弱毒诱导的转录差异分子HES4在病毒感染过程中的作用机制研究。利用CSFV强弱毒感染的PBMCs进行了转录组测序分析，发现括NF-κB和JAK-STAT等信号通路发生变化。HES4在石门株感染组中上调表达，而在弱毒C株感染组中无明显变化，利用过表达和敲低试验证实该分子负调控CSFV复制，HES4通过与CSFV IRES互作进而抑制其介导的翻译效率从而抑制CSFV复制；4）CSFV不同毒株感染SPF猪试验。将上述研究中所用的CSFV不同毒株感染SPF猪，从临床反应、病毒血症、抗体、IFN应答、病毒组织分布等方面系统评价了不同毒株对SPF猪的致病性。本项目揭示了CSFV强毒和弱毒调控IFN应答差异的分子机制，并为阐明C株致弱机制提供科学数据。