腹毛类纤毛虫纤毛病蛋白的基因筛选及其在基体的定位和功能研究

In the ciliate, there are thousands of ciliary basal bodies and complex cortical microtubular cytoskeleton system which is formed based on the basal bodies. Thus, ciliate is an ideal material for studying the interaction between the basal body and cortical microtubular cytoskeleton. Although the assembly feature and replication process of basal body have been thoroughly studied, but the proteins in basal body and their function in the assembly of cortical microtubular cytoskeleton and the maintenance of its stability in Hypotrichous ciliate remain to be further studied. In recent year, with the study of ciliopathy, many of the ciliopathy proteins were found to be the basal body proteins. It is noteworthy that most of these proteins also exist in ciliate. Given the current status of the biological function and its mechanism in the ciliate are still unclear, in the present study, we intend to use the Hypotrichous ciliate Euplotes eurystomus as material to screen the ciliopathy genes associated with the basal body, and obtain the accurate subcellular localization of their protein in the basal body. And then, interfere with their expression to display the structure, assembly dynamics and post-translational modification of the cortical microtubular cytoskeleton. The results will provide basic informations for revealing the protein composition in basal body and its function in the cortical microtubular assembly and stability, and the further study of the regulation mechanism of the microtubule assembly in ciliate.

纤毛虫细胞具有数以千计的纤毛基体，并形成以基体为中心的复杂的皮层微管类细胞骨架系统，始终是研究基体及其与微管骨架之间相互作用关系的理想材料。虽然目前对纤毛虫基体的装配特征和复制过程已有了深入的研究，但在腹毛类纤毛虫中有关基体蛋白及其参与皮层微管骨架装配以及稳定性维持方面的研究还尚待深入。近年来，随着对纤毛病研究的深入，不少纤毛病蛋白被发现为基体蛋白。值得关注的是，这些蛋白也大多存在于在纤毛虫中。鉴于目前对其在纤毛虫基体中的生物学功能和作用机制仍不清楚的现状，本项目拟以腹毛类纤毛虫阔口游仆虫为材料，筛选与基体相关的纤毛病基因并进行蛋白表达，获得其在基体精确的亚细胞定位；干扰其蛋白表达，显示皮层微管类细胞骨架的结构、装配动态和和修饰动态。预期结果将为揭示纤毛虫基体的蛋白组成及其在皮层微管骨架装配和稳定性维持过程中的作用机制，并为进一步研究纤毛虫皮层微管骨架的装配和调节机制提供基础资料。

纤毛虫细胞具有数以千计的纤毛基体，并形成以基体为中心的复杂的皮层微管类细胞骨架系统，始终是研究基体及其与微管骨架之间相互作用关系的理想材料。虽然目前对纤毛虫基体的装配特征和复制过程已有了深入的研究，但在腹毛类纤毛虫中有关基体蛋白及其参与皮层微管骨架装配以及稳定性维持方面的研究还尚待深入。近年来，随着对纤毛病研究的深入，不少纤毛病蛋白被发现为基体蛋白。值得关注的是，这些蛋白也大多存在于在纤毛虫中。鉴于目前对其在纤毛虫基体中的生物学功能和作用机制仍不清楚的现状，本项目以纤毛虫阔口游仆虫（Euplotes eurystomus）（后更名为艾美游仆虫Euplotes amieti）为研究对象，通过测序，获得了其大核基因组与转录组数据，筛选了374个人类纤毛病相关基因的同源基因，并随机验证了其中48个基因。证实了艾美游仆虫大核基因组结构上具有“微染色体”、GC含量较低、存在编程性移码等游仆虫基因组特点。通过免疫荧光和免疫电镜显示了其中两个与纤毛基体相关的纤毛病蛋白CEP43与CCDC13在细胞营养生长期和形态发生时期的细胞和亚细胞定位，揭示了两者在艾美游仆虫中均定位于纤毛基体和纤毛基部附属微管，并发现两者在游仆虫不同的生长阶段呈现不同的表达量和细胞定位。进一步通过RNAi技术对CEP43基因的功能进行了研究，首次报道CEP43蛋白对于维持运动纤毛的摆动性是必须的，并通过免疫印迹证实了CEP43可能通过与纤毛基体相关蛋白BBS8和纤毛装配相关蛋白IFT88的相互作用参与纤毛形成。揭示了γ-微管蛋白复合体通过调控CEP43参与纤毛装配过程，并能在纤毛形成后将多余的CEP43募集到游仆虫的大核上。同时也通过透射电镜技术证实了CEP43不仅具有维持纤毛轴丝微管稳定性的作用，也参与了背腹的皮下微管结构的稳定性维持。以上结果为进一步揭示CEP43在纤毛装配过程中的下游调控机制及其在维持皮层微管骨架稳定性过程中的靶蛋白提供能重要的初步证据，并为以艾美游仆虫作为模式生物深入研究纤毛病相关基因在不同类型纤毛装配过程的作用及其在背腹皮层微管骨架装配和稳定性维持等过程中的作用提功能重要的基础资料。