ASICs的表达与开放在佐剂性关节炎(AA)大鼠关节软骨细胞凋亡中的作用及其机制

Acid-sensing ion channels (ASICs) are members of the degenerin/epithelial sodium channel (DEG/ENaC) protein superfamily. Activation or sensitization of Ca2+-permeable ASICs has also been demonstrated to be responsible for acidosis-mediated diseases, including ischaemia, inflammation, epilepsy, cancer. However, it is largely unknown how the sensors adjust to these pH changes in RA. Previous studies have indicated that three ASICs subunits are expressed in articular chondrocytes of rats with adjuvant arthritis. In addition, blockade of ASICs attenuates articular cartilage destruction in rats with adjuvant arthritis, which relate to inhibition of apoptosis in articular chondrocytes. On this basis, the stable ASICs-silenced articular chondrocytes, built with RNA interference technology. We analyse the roles of different subunits in apoptosis processing of articular chondrocytes. Furthermore, ASIC currents are recorded with whole-cell patch-clamp and fast-perfusion techniques and intracellular calcium ([Ca2+]i) in chondrocytes, are recorded by using the laser scanning confocal microscopy. We analyzed the effect of Ca2+ overload on early cell apoptosis, and relationship between ASICs activation level and calcium dependence apoptosis enzymes, after suppression the ASICs with a nonspecific blocker or (and) a specific blocker. In this research proposal, we try to clarify the role of ASICs in the apoptosis of articular chondrocytes of rats with adjuvant arthritis, We therefore hypothesized that inhibiting ASICs would provide protection for the articular cartilage in adjuvant arthritis (AA) rats, and can be used as potent therapeutic targets for the treatment of acid-mediated cartilage degenerative diseases in the near future.

酸敏感离子通道（ASICs）属于DEG/ENaC超家族一员，激活可导致胞外Ca2+内流，参与某些病理反应过程。我们前期实验研究证实在AA大鼠关节软骨细胞上有ASIC1a、ASIC2a、ASIC3三个亚基表达，药物抑制其表达及通道开放对关节软骨损伤有保护作用，这种保护作用与抑制软骨细胞凋亡有关。在此基础上试图（1）通过转染特异性小干涉RNA技术，分别使ASICs亚基表达沉默，分析其参与细胞凋亡的作用及亚基类型。（2）建立全细胞膜片钳记录H+ 激活ASICs电流，Fura-4/AM探针与激光共聚焦显微镜检测细胞Ca2+浓度，分析细胞内Ca2+的超载对细胞早期凋亡的影响。（3）用特异性和／或非特异性阻断剂阻断软骨细胞ASICs，分析ASICs开放程度与细胞钙离子依赖性凋亡相关酶的关系。初步阐明Ca2+通透的ASICs在AA大鼠关节软骨细胞凋亡中的作用机制，为RA的临床治疗提供新的策略。

酸敏感离子通道（ASICs）属于DEG/ENaC超家族一员，激活可导致胞外Ca2+内流，参与某些病理反应过程。本课题前期实验证实在AA大鼠关节软骨细胞上有ASIC1a、ASIC2a、ASIC3三个亚基表达，药物抑制其表达及通道开放对关节软骨损伤有保护作用，这种保护作用与抑制软骨细胞凋亡有关。为此我们进行以下研究：（1）ASICs参与酸诱导AA大鼠关节软骨细胞凋亡的作用，结果显示：①胞外酸化刺激均能够抑制软骨细胞活力，增加LDH释放并且促进软骨细胞的早期凋亡。②给予ASICs阻断剂阿米洛利能够抑制胞外酸化引起的软骨细胞凋亡。（2）ASIC1a在酸诱导关节软骨细胞凋亡中的作用，结果显示：ASIC1a的表达沉默和特异性阻断剂(PcTX1)也可以抑制胞外酸化诱导的软骨细胞凋亡，使Ⅱ型胶原表达增多，并且降低Bax/Bcl-2比值。（3）ASIC2a在酸诱导的软骨细胞凋亡中的作用，结果显示：①ASIC2a过表达可以明显降低酸诱导的凋亡，提示ASIC2a可能在软骨细胞损伤中发挥保护作用。②ASIC2a过表达后可使ASIC1a的表达变化，而在酸化情况下，ASIC2a上调后使ASIC1a表达下降，推测两亚基之间可能存在拮抗作用。③ASIC2a过表达能促进Bcl-2，Bcl-xl表达，降低Bax表达。（4）ASICs参与酸诱导的软骨细胞凋亡的部分机制，结果显示：①胞外酸化引起胞内Ca2+的超载，进而导致线粒体膜电位（Δψm）降低、细胞色素C释放、Caspase-3/9活性水平增加，最终引起软骨细胞的凋亡。②阿米洛利、沉默ASIC1a及过表达ASIC2a均能抑制酸诱导软骨细胞Δψm降低和线粒体途径凋亡有关蛋白表达的变化及MAPK信号通路的激活。③阿米洛利和/或PcTX1阻断软骨细胞ASICs，可以抑制酸诱导的calpain和calcineurin的表达。（5）ASIC1a在酸诱导的软骨细胞基质代谢中的作用，结果显示：①胞外酸化刺激可通过激活 ASIC1a 调控关节软骨细胞对 GAG、HYP、MMP-2/9、TIMP-1/2的代谢。ASIC1a 表达沉默可阻断这种作用。②ASIC1a通过激活Ca2+依赖的MAPK信号通路调控酸诱导的软骨细胞基质代谢。以上结果显示Ca2+通透的ASICs在AA大鼠关节软骨细胞凋亡中发挥重要的作用，针对ASICs为靶点开发药物将为RA的临床治疗提供新的策略。