基于磁性/SERS复合纳米探针“双增强SERS”效应的肝癌循环肿瘤细胞特异性检测技术研究

As "liquid biopsy specimens", circulating tumor cell (CTC) can be applied for high-risk tumor early screening, tumor recurrence and metastasis monitoring real-timely and noninvasively, which provides important basis for pathograhy and therapeutic schedule planning, the key restriction for clinical CTC detection is the improvement of the specificity and sensitivity. This project designed a magnetic/SERS composite nanoprobes system for hepatocellular carcinoma circulating tumor cell specific detection based on the "dual enhanced SERS”. Firstly, the Fe3O4@Ag was designed as “magnetic/SERS” capture base, Au@Ag nanorod@raman tag was designed as SERS probe, based on the “dual-enhanced” of the Ag shell of the Fe3O4@Ag nanobase and the Au@Ag of the SERS nanoprobe, the signal intensity of the raman molecule can be increased doubly to increase the sensitivity and realize the individual CTC detection. Secondly, anti-ASGPR (liver cell marker) magnetic SERS nanobase was fabricated to capture the liver cells in the blood samples (capture selectivity); anti-GPC3 (hepatoma carcinoma cell marker) SERS nanoprobe was fabricated to label the hepatocellular carcinoma cells in the magnetic enrichment region(label selectivity).Based on the “dual-selective ”system, the cells except hepatoma carcinoma cell can be eliminated and the specific hepatoma carcinoma cell detection can be realized. This detection system is expected to become a powerful tool for hepatocellular carcinoma CTCs clinical capture, labeling and detection.

循环肿瘤细胞（CTC）作为“液态活检标本”，可用于高危肿瘤患者早期筛查，监测肿瘤复发与转移，为预后判断提供重要依据。目前临床CTC检测的灵敏度和特异性均受到限制，针对这一问题，本项目构建了基于磁性/SERS复合纳米探针“双增强SERS”效应的肝癌CTC检测体系。设计银壳磁珠（Fe3O4@Ag）作为“磁性捕获/SERS增强”双功能基底，Au@Ag纳米棒@拉曼分子作为共振SERS探针。基于基底和共振探针的“双增强SERS”性能，拉曼分子可产生双重信号增强，提高检测灵敏度达到单细胞检测水平；利用ASGPR抗体（肝源性细胞标志物）修饰Fe3O4@Ag，富集血样中的肝源性细胞（富集选择），利用GPC3抗体（肝癌细胞标志物）修饰SERS探针，对富集的肝癌细胞进行特异性标记（标记选择）。通过“双选择”，实现肝癌细胞的特异性检测。该检测体系有望成为实现临床肝癌CTC富集，标记，检测一体化的有力工具。

背景：肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，研究证明，循环肿瘤细胞（CTC）的数目与肿瘤的发展分期呈正相关，因此，CTC 可以作为肿瘤产生和发生转移的“液态活检标本”进行肿瘤的早期筛查和转移监测，进而为病情评估和制定治疗方案提供依据。然而，肿瘤患者外周血中 CTC 的数量非常之少（1～10 个/毫升），因此，CTC 研究的关键在于实现复杂的全血环境中 CTCs 的特异性和高灵敏检测。 . 研究内容：针对CTC临床检测难点，本项目构建了基于功能化磁性纳米材料表面增强拉曼散射（SERS）技术的肝癌 CTCs 快速富集和高灵敏检测方法。首先构建银壳磁珠作为磁性/SERS 增强双功能基底，通过ASGPR 抗体（肝源性细胞标志物）修饰Fe3O4@Ag，实现血样中肝源性细胞的富集；其次构建肝癌细胞标志物GPC3 抗体-Au@Ag@DTNB 纳米SERS探针，实现肝源性细胞中肝癌细胞进行特异性标记。同时，作为富集基底的Fe3O4@Ag可以进一步放大SERS探针的拉曼信号强度。.重要结果、关键数据及研究意义：成功构建了ASGPR-Fe3O4@Ag体系，实现血样中肝源性细胞选择性富集，成功构建了GPC3-SERS探针，实现了对富集的肝细胞进行肝癌细胞的特异性标记。因此，本体系通过“双增强SERS”和“双选择”捕获标记可以实现血样本中肝癌 CTCs 的特异性捕获和标记。经测试，该体系具有良好的特异性，可以成功区分HepG2（肝癌细胞）, MCF-7（乳腺癌细胞）以及L-02（正常肝细胞） 细胞系。通过“双选择”，实现肝癌细胞的特异性检测，整个检测过程不需要复杂样本前处理，检测限低至1 CTC cell /mL,血清环境中线性范围1-100 CTC cell /mL，可以满足实际样本中CTC检测需求。最后，将检测方法用于临床血清样本，成功区分了肝癌患者和健康样本。基于该方法有望实现临床肝癌CTC富集，标记，检测的一体化。