新型金纳米双锥SERS探针对肿瘤细胞的逐层解析

The previously reported surface enhanced Raman scattering (SERS) probe detection methods focus on the analysis of one certain type of substance, thus fail to obtain the multilayer fingerprint information from cell surface to cytoplasm. It is of great significance for the early diagnosis, real-time monitoring and treatment of tumor to develop the method of using nanotechnology in combination with SERS for two-functional in-situ imaging analysis of tumor marker molecules on the surface of cell membrane and intracellular. This project proposes a new complex SERS nanoprobe which can be separated layer by layer, using functional gold nanobipyramids as the substrate, Raman markers B on its surface functionalization could specifically recognize intracellular tumor markers (ROS), and link again Raman markers A on its surface functionalization could specifically recognize cell surface sialic acid (SA), multi-functional composite SERS nano probes were obtained. The SA-specific markers A, leaving from the probe surface and binding on cell membrane. After the probes enter into the cytoplasm, the markers B can specifically recognize ROS in cytoplasm and depart from the probe surface. At the same time, the SERS scattering spectra changes of probe can be observed under a dark-field microscope, which are used for the localization of the intracellular probes and the monitoring of Raman molecules departure processes on probe surface, the using darkfield microscopy, image analysis and in situ real-time distribution of molecules on the cell membrane surface and intracellular markers. This new type of SERS nanoprobe has been developed to further study the physiological process of early diagnosis of tumor.

目前已有的表面增强拉曼(SERS)探针分析方法主要集中于检测单一物质，无法得到从细胞表面到细胞内多层次的指纹信息。利用SERS技术发展细胞表面及细胞内肿瘤标志分子的双功能原位成像分析方法，对肿瘤的早期诊断具有十分重要的意义。本项目拟构建层层分离的新型SERS探针，以功能化的金纳米双锥为基底，在其表面修饰可特异性识别细胞内目标小分子(ROS)的拉曼标记分子B，再连接可特异性识别细胞表面唾液酸(SA)的拉曼标记分子A，得到多功能复合SERS探针。分子A识别SA后解离并标记在细胞表面；再进入细胞，其探针表面修饰的分子B可特异性结合细胞内ROS并脱离金纳米双锥表面。通过观察SERS谱峰的变化可定位监测探针进入细胞前后的分布情况以及探针表面拉曼分子的反应过程，利用暗场显微镜成像分析技术对探针在细胞表面及细胞内的分布情况进行实时、原位分析，并为SERS纳米探针应用于肿瘤的早期诊断和监测提供新方法。

肿瘤细胞环境复杂，细胞内代表性的肿瘤标志分子，如大部分恶性肿瘤细胞表面的聚糖链末端唾液酸残基是过表达的，还有如ROS (reactive oxygen species)、microRNA (miRNA)、p53蛋白等，研究者发现这些肿瘤标志物过量积累会破坏细胞内的平衡，导致一系列的功能絮乱，诱导疾病、细胞的癌变和凋亡，目前已有的SERS探针分析方法主要集中于检测单一物质，无法得到细胞表面及细胞内多层次的“指纹”信息。利用纳米技术结合SERS、PRRS技术，构建了一系列新型纳米复合探针，显著提高了探针在细胞中的特异性识别，获取细胞不同位置标志分子的“指纹”信息，并且研究细胞内外不同肿瘤标志分子表达水平之间的内在关联，对肿瘤细胞的监测和分析具有十分重要的意义。本项目构建了一系列肿瘤细胞表面及细胞内分子探针，如设计了基于金纳米颗粒的自组装等离子体纳米束，用于研究肿瘤光热治疗时p53蛋白表达的通路关系，该体系在细胞表面结合时，DFM成像可以观察到AuNPs的自组装聚集，并可以通过等离子体瑞利散射谱（plasmon resonance Rayleigh scattering，PRRS），针对探针在肿瘤细胞表面的光照治疗从而发现细胞内p53蛋白的变化，为癌症的诊断提供了新的思路。进一步，通过细胞表面及细胞内同一物质不同方法的双探针设计，选择唾液酸作为肿瘤标志物。利用金纳米颗粒包裹光敏剂BDP，制备了具有光动力功能的拉曼/荧光双成像的唾液酸靶向纳米传感器。研究结果表明，当光敏剂BDP与细胞膜表面SA相结合时，BDP荧光产生，同时BDP的拉曼信号会发生改变，得到拉曼/荧光双重信号。在近红外光的照射下，显著提升肿瘤细胞内单线态氧的产生，强有力地诱导MCF-7细胞死亡。为肿瘤细胞的监测和治疗提供了新的策略。更进一步，设计了细胞内两种不同物质的双功能探针，首次利用单个探针同时追踪caspase-3和H2O2的动态变化，为肿瘤细胞环境中caspase-3和H2O2的分析提供了一个高精度、灵敏度、方便、高效的新平台。