鸭甲肝病毒感染调控内质网应激反应的分子机制

Endoplasmic reticulum stress response (ERSR) is closely related to virus proliferation and cell apoptosis induced by virus infection. Duck hepatitis A virus (DHAV) infection in ducklings induces cell apoptosis in multiple organs, especially characterized by acute hemorrhagic necrosis of liver with a large number of apoptotic cells. However, the molecular mechanism of cell apoptosis and ERSR induced by DHAV infection remains unclear. In this study, based on the establishment of a model of DHAV infected DEF cells, using RNA interference, signal pathway blocking, flow cytometry analysis, confocal laser scanning microscopy, immunoprecipitation, Pull down, and virus mutant construction and other techniques, the signal pathways in the regulation of ERSR and cell apoptosis induced by DHAV infection will be investigated, the DHAV proteins participating in regulation of the ERSR and cell apoptosis will be identified, and the interactions among the ERSR, cell apoptosis and DHAV replication will be clarified. The results will reveal the molecular mechanisms of the ERSR induced by DHAV infection in regulating cell apoptosis and viral replication.

内质网应激反应与病毒增殖及细胞凋亡关系密切。鸭甲肝病毒（DHAV）感染雏鸭后引起多个脏器的细胞凋亡，特别是肝细胞大量急性凋亡并导致肝脏特征性出血坏死。但是DHAV感染细胞后引起的内质网应激反应和细胞凋亡的分子机制尚不清楚。本项目拟建立DHAV感染DEF细胞模型，采用RNA干扰、信号通路阻断、流式细胞术、激光共聚焦显微镜、免疫共沉淀、Pull down、病毒突变体构建等技术，研究DHAV感染对宿主细胞内质网应激反应与细胞凋亡信号通路的调控，筛选和验证参与调控内质网应激反应与细胞凋亡的病毒蛋白，探讨内质网应激反应、细胞凋亡与DHAV增殖之间的关系。研究结果有助于深入理解DHAV感染诱导的内质网应激反应对细胞凋亡和病毒增殖进行调控的分子机理。

1型鸭甲肝病毒（DHAV-1）属于小RNA病毒科，禽肝病毒属，主要引起1~3周龄雏鸭发生鸭病毒性肝炎（DVH），引起多个脏器的细胞发生凋亡，然而，其凋亡机制尚不清楚。在病毒复制过程中，会产生大量的病毒蛋白，当它们不能被正确的折叠修饰和及时输出时，可启动内质网应激反应（ERSR），进而诱导未折叠蛋白反应（UPR）。ERS在许多病毒感染中发挥作用，不仅与病毒增殖和细胞凋亡有关，而且还可以调控细胞自噬水平。本研究首先通过蛋白质组学研究提示DHAV-1感染过程中可能引起ERS，并与细胞自噬过程有关；通过透射电镜观察和Western blot（WB）检测表明了DHAV-1感染能够引起ERSR, 且不具有细胞特异性; DHAV-1感染激活了UPR通路中的PERK和IRE1两条途径，但不激活ATF6途径；DHAV-1感染诱导了ERS介导的自噬，且ERS及其介导的自噬对DHAV-1增殖起促进作用。免疫荧光、DNA Ladder检测、Hoechst33342染色及Western blot分析证实了DHAV-1感染诱导ERS介导的细胞凋亡，而且PERK/PKR-eIF2α-ATF4途径参与了DHAV-1诱导的凋亡与复制过程。筛选和鉴定结果表明DHAV-1结构蛋白VP0、VP1、VP3及非结构蛋白2A2、3C共同参与DHAV-1诱导的ERSR及细胞凋亡，其中结构蛋白VP1起主要作用。本研究针对DHAV-1感染后诱导的ERS及其介导的自噬、凋亡的分子机制进行的研究为进一步揭示DHAV-1感染的致病机理提供了重要的理论基础。