鸭甲肝病毒复制相关的主要酶蛋白功能探究

Duck hepatitis A virus (DHAV) can cause an acute, highly contagious disease within three weeks ducklings which the mortality rate is 90-95 % and lead to an extremely serious harm in duck industry. However, no any research works involved in the proteases function with the replication process were investigated at domestic and oversea. This research project mainly concentrate on the functional role of 2Apro、3Cpro and 3Dpol in the process of replication, includingⅠ, the number of 2Apro、function and mechanism auto-cleavage and it's affecting factors、sub-cellular localization and the interaction with viral RNA and the relationship with apoptosis;Ⅱ, proteolysis activity of 3Cpro and its influencing factors、binding activity with viral RNA, and the relationship with apoptosis; Ⅲ, RNA dependent RNA polymerase (RdRp) activity and immune enhancement by 3Dpol; Ⅳ, application of prophylaxis and treatment of 2Apro、3Cpro and 3Dpol: exploration of antiviral therapy and an empty capsid vaccine based on 2Aproand 3Cpro, and the immune adjuvant effect by 3Dpol, all those works are vital to elucidate the function of 2Apro、3Cpro and 3Dpol. Those investigations will further the understanding of DHAV replication and proliferation, and then provide scientific data and theoretical guidance for elucidating the pathogenic mechanisms and new vaccine design and drug development of DHAV which has important scientific value, theoretical and practical significance.

鸭甲肝病毒(DHAV)可引起3周龄以内雏鸭发生急性、高度接触性传染病，发病急，致死率可达90-95%，危害严重。但目前国内外尚无关于DHAV酶蛋白在病毒复制中作用的研究，本研究对DHAV的主要酶蛋白2A、3C和3D在病毒复制中的作用进行研究，包括：①2A的数目、自我剪切功能及机制、影响自我剪切功能的因素、亚细胞定位及与病毒RNA的相互作用、与细胞凋亡的关系；②3C的蛋白水解活性及其影响因素、RNA结合活性、与细胞凋亡的关系；③3D的RdRp酶活性和免疫增强作用；④2C、3C和3D功能在防治中的应用：探究基于2A和3C的抗病毒治疗、利用2A和3C构建空衣壳疫苗及3D的免疫佐剂作用，从而解析2A、3C和3D的功能。研究结果将加深人们对DHAV复制与繁殖过程的认识，为阐明DHAV的致病机制提供科学数据，为防治DHAV新型疫苗和新药研究提供理论指导，具有重要科学价值、理论和实际意义。

①DHAV-1的全基因组及2A、3C和3D基因进行了全面生物信息学分析和基因功能预测，为2A、3C和3D等基因功能的研究提供了理论依据和参考。②建立了一系列DHAV检测方法，为DHAV诊断提供了可靠的方法。③证明了DHAV增殖中的凋亡和自噬特性，为2A/3C/3D等基因功能的研究提供了依据。④获得了DHAV的2A、3C和3D等重组蛋白及其抗体，建立了一系列基于这些蛋白和抗体的检测方法，为2A/3C/3D基因功能的研究提供可靠的检测试剂和方法。⑤确认了DHAV-2A功能：2A蛋白由NPGP样2A1、GTPase样2A2和H-NC样2A3组成，2A1与2A2、2A2与2A3间的切割位点分别是NPG/P和S/H；2A1蛋白可自我切割(核糖体跳跃“裂解”)且其N端延伸长度和关键氨基酸突变对核糖体跳跃有影响；2A2蛋白主要分布在胞核、少量分布在胞质，具有GTP酶活性并能诱导DEF凋亡；2A3蛋白主要分布在胞质、少量分布在胞核，可与病毒RNA互作。⑥确认了DHAV-3C功能：具有水解病毒多聚蛋白的活性；还能水解鸭PAPB，切割位点为Q367/G368；靶向PABP的siRNA可抑制DHAV复制，过表达PABP可促进病毒复制；3C蛋白能诱导DEF凋亡；AG7088是不可逆性DHAV-3C蛋白抑制剂，具抗病毒活性；⑦确认了DHAV-3D功能：具有RdRP活性；能与基因组3’ UTR结合，其结合位点为149~201位及310~335位碱基；靶向3D蛋白在3’ UTR上结合位点的siRNA可抑制DHAV复制；3D蛋白能增加DHAV免疫鸭的细胞和体液免疫并对DHAV感染鸭有一定的免疫保护作用；3D蛋白及其抗体可分别用于检测DHAV感染鸭血清中抗体、DHAV感染及3D蛋白在组织中分布。这些研究结果可加深人们对DHAV复制与繁殖过程的认识，为阐明DHAV的致病机制提供了科学数据，为防治DHAV新型疫苗和新药研究提供理论指导，具有重要科学价值、理论和实际意义。