茶树铵、硝偏性吸收特性及调控机理研究

Different nitrogen form affect tea plant growth and closely related to tea quality. In tea plants, the preference for ammonium compared to nitrate was obviously, however, the key mechanism in physiological and molecular level is still unknown. Theanine is a unique non-protein amino acid found almost exclusively in tea, it has a unique taste characteristic of tea known as “umami”. Prior to the present study, research on regulation of ammonium and nitrate uptake in tea plant by theanine had not been reported. With the application of molecular biology technology, clone and molecular characterizaiton of the ammonium transporter(AMT)and nitrate transporter(NRT)gene will be studied based on the previous work.The expressions of AMT and NRT gene and the key genes of theanine synthesis pathway were compared after different nitrogen source incubation, through isotope (15N labeling) tracer, the systhesis dynamic condition of theanine were researched at the same time. In addition, the feedback regulation of ammonium and nitrate uptake by metabolites were discussed through inhibitors（MSO, AZA, AOA and Na2WO4）addition combined with feeding theanine or glutamine into the uptake solution.The study will reveal the ammonium and nitrate uptake and assimilation system, further prove the process and characteristics of the preference for ammonium in tea plants and provide the effective theory basis to increase the use of nitrogen in tea plants.

不同形态氮素不仅影响茶树的生长发育，而且与茶叶品质密切相关。茶树偏好铵态氮，但其偏铵特性的形成机制尚不清楚。茶氨酸是茶树的特征代谢产物，也是决定茶叶品质的重要组成，其对茶树吸收不同形态氮素是否存在调控作用有必要加以明确。本研究拟在已有工作基础上，进一步应用分子生物学的研究方法，克隆茶树铵转运蛋白（AMT）家族和硝转运蛋白家族（NRT）基因，对其基因功能进行验证。设立不同氮源处理，研究茶树AMT、NRT及茶氨酸合成途径关键基因表达差异，并运用15N同位素示踪技术追踪茶氨酸合成动态的差异；通过外源添加茶氨酸、谷氨酰胺等代谢产物结合使用氮代谢过程中关键酶抑制剂（MSO、AZA、AOA和Na2WO4）抑制茶树体内茶氨酸的合成，比较代谢产物对茶树AMT和NRT的反馈调节特性。旨在从不同角度明确茶树铵、硝营养特征差异机制，进一步探明茶树偏铵特性形成的生理和分子机理，为茶树氮素高效吸收利用提供理论依据。

不同形态氮素不仅影响茶树的生长发育，而且与茶叶品质密切相关。茶树偏好铵态氮，但其偏铵特性的形成机制尚不清楚。本项目通过3年的研究工作，克隆了茶树硝态氮转运蛋白基因（NRT1.1）的cDNA全长序列，基因序列全长1 880 bp，其中开放阅读框（ORF）1 788 bp，编码595个氨基酸，预测蛋白质分子量为65.9 kD，理论等电点为8.99，命名为CsNRT1.1，并对其进行了生物信息学分析及功能验证。通过llumina高通量测序技术对不同氮源（铵态氮、硝态氮和铵硝混合）分别处理5分钟和96小时的茶树不同部位（芽、成熟叶、茎和根）混合样进行测序，将低质量数据过滤后，8个RNA库共得到52.65 Gb数据，平均每个样本6.58Gb。从转录组学水平上研究了茶树次生代谢合成途径对不同氮源的应答响应，揭开不同条件下的氮素代谢通路和分子调控网络，获得的差异表达基因（DEGs）表明，铵态氮处理的茶树次成代谢途径中的DEGs明显比硝态氮处理及铵硝混合处理的DEGs丰富，证明了茶树偏好铵态氮的特性。建立了利用15N-NH4+和15N-NO3-培养-气相色谱-质谱（GC-MS）联机分析茶树根部和叶片中15N富集的方法，分析了不同氮素水平和不同氮源的预培养对茶树同化铵态氮和硝态氮过程的影响，研究表明茶树同化不同氮源差异主要体现在谷氨酰胺而不是茶氨酸含量上，说明谷氨酰胺在茶树吸收N同化转运中发挥着更为重要的作用。进一步探明茶树偏铵特性形成的生理和分子机理，为茶树氮素高效吸收利用提供理论依据。