从TREM2甲基化水平探讨针刺干预AD的作用机制

Alzheimer’s disease (AD) is the major problem to be solved urgently facing world public health. Neuronal apoptosis caused by activated microglia is the key reason of process of AD. From our former research, we found acupuncture could reduce the amyloid-β deposition，inhibit neuroinflammation reaction, and protect neuron, which had a close relation to upregulate the express of TREM2 on microglia. Therefore, based on these we propose the scientific hypothesis: the mechanism of acupuncture inhibiting microglia activation and protecting neuron is resulting from acupuncture could regulate the level of TREM2 gene related region DNA methylation. We will use senescence accelerated mouse prone 8 (SAMP8) as AD animal model. In order to explore the mechanism of acupuncture in neuron protection in AD and provide scientific evidence for application of acupuncture in clinic, double immunofluorescence labeling method（DILM），western blot, real time-qPCR, methylcysine-DNA immunoprecipitation followed by high throughput sequencing (MeDIP-seq) and hydroxymethylcysine-DNA immunoprecipitation followed by high throughput sequencing (hMeDIP-seq) will be applied to observe the level of TREM2 gene related region DNA methylation and analysis the effect on TREM2 protein expression regulation.

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是世界公共卫生领域亟待解决的重大难题，由小胶质细胞活化导致的神经元凋亡是其疾病进展的关键环节。课题组前期研究发现针刺具有改善Aβ沉积，控制炎症反应，保护神经元等作用，其作用机制与上调小胶质细胞TREM2表达关系密切。本项目在此基础上，提出“针刺通过调节TREM2基因相关区域甲基化水平，抑制小胶质细胞活化，从而保护神经元”的科学假说，研究拟采用SAMP8模型小鼠为研究对象，运用双重免疫荧光标记技术、western blot技术、适时定量荧光PCR技术、（羟）甲基胞嘧啶-DNA免疫沉淀结合高通量测序技术等分子生物学及表观遗传学研究方法，观察TREM2基因相关区域甲基化水平，明确其对TREM2蛋白表达调控的影响，以期揭示针刺干预AD的神经元保护机制，并为其临床应用提供科学依据。

对于世界公共卫生领域亟待解决的难题——阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD），针刺干预具有积极的临床疗效；但其深层作用机制尚不十分明晰。基于由小胶质细胞活化介导的神经炎性反应是导致神经元凋亡的最直接因素，结合课题组前期研究发现针刺具有通过上调小胶质细胞TREM2水平而实现保护神经元的作用，本项目提出“针刺干预AD的深层作用机制是否能通过影响TREM2基因相关区域甲基化水平而实现”的科学问题；并采用公认AD动物模型快速老化小鼠为研究对象，运用双重免疫荧光法、Western blot、Real time-qPCR及（羟）甲基胞嘧啶-DNA免疫沉淀结合高通量测序技术检测TREM2基因相关区域甲基化水平对TREM2蛋白表达调控的影响。研究发现：电针连续干预SAMP8小鼠百会穴与印堂穴15天，可以显著改善其空间学习记忆能力（p<0.05），HE染色结果证实，电针可有效改善模型动物海马齿状回的神经元凋亡情况。运用双重免疫荧光标记与Western blot检测，发现经电针干预后，可显著上调模型动物海马区TREM2的蛋白表达（p<0.01）；运用Real time-qPCR分析发现模型动物海马区的TREM2 mRNA 在AD模型组显著高于电针组（p<0.01），与蛋白表达情况呈负相关。运用（羟）甲基胞嘧啶-DNA免疫沉淀结合高通量测序技术检测TREM2基因相关区域甲基化水平对TREM2蛋白表达调控情况，发现电针可以使位于模型动动物17号染色体上的TREM2基因第一内含子与第二外显子上的5-甲基胞嘧啶水平的下调（p<0.05），以及第一内含子和第二外显子5-羟甲基胞嘧啶水平的上调(p<0.01)，可能是电针促进TREM2蛋白表达的深层机制。综上，本项目证实了“针刺通过影响TREM2基因相关区域的甲基化水平，从而抑制小胶质细胞活化，保护神经元”的假说，揭示了针刺干预AD的深层作用机制。