从苓桂术甘汤干预Aβ转运、沉积、致损伤研究探讨温脾化饮治疗AD生物学机制

The pathophysiological research of AD has shown that the inflammatory is the influencing factor which can alter the permeability of the blood-brain barrier, lead to the Aβ transport disorders and deposition.They has also shown the glycosylation caused by advanced glycation endproducts (AGEs) of Aβ exacerbate the deposition of Aβ and the damage to neurons .The previous study confirmed that Linggui Zhugan decoction, a prescription of warming spleen to resolve fluid retention,can treat the Alzheimer's disease (AD) by reducing the deposition of Aβ and the Aβ - induced inflammatory injury of neurons.And this efficacy of Linggui Zhugan decoction can reflect the relevancy of inflammatory of AD and fluid retention stagnating in the interior causing by spleen deficiency. Can Linggui Zhugan decoction intervene the pathophysiological process of AD much more,when it take effect as described above at the same time? The proposed application which is based on the observation of the effect of Linggui Zhugan decoction on the AD rats and its cerebrospinal fluid in vitro blood-brain barrier (BBB) cell model will confirm whether Linggui Zhugan decoction have the effect on protecting the BBB cytoskeletal protein ZO-1,Claudin-5 , recovering the dynamic regulating of the Aβ transporter such as RAGE,LRP-1 and P-gp , and protecting the glycosylated-Aβ-induced neuronal injury or not. Through the above research, we try to corroborate the correlation of "AD-BBB transport imbalance-Aβ deposition-inflammation-phlegm- warming spleen to resolve fluid retention” and define its biological basis.

AD病理生理研究表明，炎症是AD病人血脑屏障通透性改变、Aβ转运失常并沉积的影响因素，晚期糖基化终产物（AGEs）对Aβ糖基化修饰加剧了其沉积及对神经元的损伤。前期研究证实：温脾化饮苓桂术甘汤能通过减少Aβ沉积、减轻神经元炎症损伤，实现对阿尔茨海默病（AD）有效治疗，反映AD炎症病理与脾虚饮停之间关联。苓桂术甘汤在发挥上述效应的同时，是否还存在对AD病理生理过程更多环节干预？拟申请项目将在观察苓桂术甘汤对AD大鼠整体效应、该方含药脑脊液对体外血脑屏障(BBB)细胞模型作用基础上，明确该方对ZO-1、Claudin-5等BBB骨架蛋白，对RAGE、LRP-1及P-gp等Aβ转运相关蛋白是否具有动态调节作用，对糖基化修饰后Aβ致神经元损伤具有保护作用。通过上述研究，冀能证实“AD-BBB转运失衡-Aβ沉积-炎症-脾虚饮停-温脾化饮”的相互关联，明确其生物学机制。

前期研究发现，苓桂术甘汤（LGZG）能通过减少Aβ沉积、减轻神经元炎症损伤，实现对阿尔茨海默病（AD）有效治疗，反映AD炎症病理与脾虚饮停之间关联。本研究在此基础上，重点关注LGZG对AD模型大鼠行为学及血脑屏障通透性的影响，研究发现不同剂量LGZG的干预下，AD大鼠的认知功能障碍有较好的改善作用，脑组织病理损伤均得到了不同程度的改善，脑组织内Aβ1-42的表达显著减少，提示LGZG能够改善AD模型大鼠的病理性损伤，且呈现LGZG剂量依赖性关系；关注LGZG含药脑脊液对血脑屏障损伤干预机制、LGZG含药脑脊液干预血脑屏障上Aβ转运失衡分子机制，研究发现当大鼠脑组织Aβ表达增加时，MAPK和NF-κB 2条信号通路的相应激活和炎性因子的表达增加，LGZG干预后上述病理改变均得到不同程度的改善。经过LGZGl治疗，RAGE和LRP-1得到不同程度的调节作用，进一步佐证BBB转运是Aβ清除的重要途径。同时，在体外建立Aβ1-42导致的AD脑微血管内皮细胞（BMEC）损伤模型，观察内皮细胞的损伤程度，发现RAGE和LRP-1两个蛋白在不同时间点中的动态变化，以及LGZG的干预作用，研究发现，BMEC上2个Aβ转运蛋白LRP-1和RAGE的动态平衡被打破，致使Aβ转运出脑减少，在脑内聚集的Aβ增多，增强了脑内炎性反应，损伤脑神经元，造成了以认知功能障碍为典型表现的脑功能紊乱，LGZG能较为有效地改善上述病理过程，LRP-1/RAGE比值平衡显著改善，减轻脑内Aβ的堆积；LGZG含药脑脊液对糖基化修饰后Aβ致神经元损伤保护效应表明，LGZG含药脑脊液在一定程度上可以降低GSK-3β、RAGE和p-tau蛋白表达，从而改善Aβ-AGE造成的细胞损伤；而LGZG调控中枢神经元自噬的生物学机制研究表明，LGZG抑制APP/PS1 AD小鼠海马组织自噬功能受损伴随着mTOR信号通路的紊乱是通过促进AD小鼠海马神经元自噬，抑制过度激活的mTOR信号通路，促进自噬增加对Aβ的降解清除有关。本课题的研究结果表明，苓桂术甘汤存在着包括促进血脑屏障转运清除途径、中枢淋巴系统转运清除途径以及自噬溶酶体途径等多种途径清除脑内Aβ的机制，这些机制可能是苓桂术甘汤改善AD认知损伤的关键因素，提示苓桂术甘汤具有防治AD的良好应用前景。