嗜盐古菌Tat及Sec信号肽在胞外蛋白酶折叠、成熟及转运过程中的作用差异性的分子机制

During protein translocation, Sec substrates are secreted in an unfolded state via universally conserved secretory (Sec) pathway, while folded Tat substrates are secreted through the twin-arginine transport (Tat) pathway. Haloarchaea thrive in extremely saline environments and are distinguished from other organisms in that, Tat pathway is employed for the translocation of the majority of their extracellular proteins across cytoplasmic membrane. Meanwhile, haloarchaea also encode components of the general Sec pathway, and there are many haloarchaeal proteins that are exported through the Sec pathway. Sec and Tat signal peptides are key structural elements of Sec and Tat substrates. However, the role and mechanism of signal peptides in the folding of haloarchaeal proteins remains unclear. The investigation of the roles of Sec and Tat signal peptides in the folding of Sec and Tat substrates is of great importance for further understanding of the protein translocation and adaptation mechanism of haloarchaea. In this research proposal, we are going to probe the molecular basis for the role of Sec and Tat signal peptides in the folding, maturation and translocation of several homologous proteases from haloarchaeon Natrinema sp. J7-2. We hope this study could provide new insight into the molecular basis of protein translocation and adaptation mechanism of haloarchaea. In addition, the elucidation of the mechanism of haloarchaeal protein translocation is expected to provide a rational basis for developing expression vector designed for protein secretion in haloarchaea.

在蛋白质的跨膜转运中，Sec及Tat底物分别以去折叠形式和折叠形式通过各自不同的途径进行。作为生活在高盐环境中的极端微生物，嗜盐古菌区别于其它类型生物的一个显著特征是其胞外蛋白多通过Tat途径跨膜转运。同时，也有部分胞外蛋白通过Sec途径跨膜转运。Tat及Sec信号肽是跨膜转运蛋白能否实现跨膜转运的关键结构元件。然而，目前尚不清楚嗜盐古菌信号肽在转运蛋白折叠过程中的作用及机制。本项目以来源于同一嗜盐古菌 Natrinema sp. J7-2 的多个同源胞外蛋白酶为研究对象，利用它们具有相似分子结构特征却分别含有Tat及Sec信号肽的优势，比较分析Tat及Sec信号肽在蛋白折叠、成熟及跨膜转运过程中的作用机制，寻找其中可能存在的差异及蕴含的规律，在理论上获得对Tat及Sec底物跨膜转运分子机制和嗜盐古菌独特适应机理的新认识，在应用方面为构建嗜盐古菌高效分泌表达载体及其应用提供新的设计依据。

蛋白质的跨膜转运主要有两种途径，一种是介导未折叠蛋白质跨膜转运的Sec途径，另一种是介导折叠和/或含辅因子蛋白质分泌的Tat途径。我们对来源于嗜盐古菌Natrinema sp. J7-2作为Sec底物的胞外蛋白酶SptE和Tat底物的胞外蛋白酶SptA分别进行了研究，发现：1. SptE前体通过切除N端而自加工成熟，且具有较高底物特异性，信号肽对SptE的分泌必不可少但不影响蛋白酶的加工成熟，C端延伸区对SptE的加工成熟至关重要但不影响蛋白酶的分泌，SptE的Sec信号肽替换为Tat信号肽后SptE也可分泌至胞外。SptE是首个被实验证实的Sec途径转运的极端嗜盐古生菌胞外丝氨酸蛋白酶。我们对Tat底物的蛋白酶SptA与Sec底物SptE的转运特点进行了比较，推测嗜盐古菌蛋白质折叠校正监控系统可能不同于细菌。2. sptA转录本处于同一开放阅读框内的两个起始密码子AUG1和AUG2均可以起始翻译，且采用不同的翻译起始机制——从AUG1起始翻译的转录本为leaderless转录本，使用leaderless机制起始翻译；从AUG2起始翻译的转录本为leadered转录本，采用SD-less机制起始翻译，该翻译起始过程没有采用核糖体扫描机制，且翻译效率不受上游SD序列的影响。将AUG1和AUG2突变后不仅导致sptA转录本翻译效率显著降低，同时也导致转录本稳定性大幅下降，表明AUG在维持sptA转录本高翻译效率和高转录本稳定性方面均发挥重要作用。3. sptA 5’的-51 bp到-43 bp区域含有负调控顺式作用元件，从-174 bp到-116 bp区域含有的正调控顺式作用元件作为远距离增强子发挥功能。多个顺式调控元件协同调节sptA的生长期依赖性表达，使得SptA在J7-2菌株的不同生长阶段适当地发挥其功能。4. 在J7-2菌株中找到TrmBL2类蛋白NJ7G_0096，发现该蛋白能与sptA的启动子DNA片段结合，可能参与sptA基因转录调控。对分别具有Tat和Sec信号肽的蛋白酶SptA和SptE的研究丰富和深化了信号肽在蛋白质跨膜转运这一基本生物学过程中发挥重要功能的理解，我们还深入揭示了嗜盐古生菌的翻译起始过程，为研究古菌特别是极端嗜盐古菌蛋白质的分泌、转录调控和翻译机制提供了新的信息，为深入认识嗜盐古菌的独特适应机理提供了新见解。