嗜盐古菌胞外蛋白酶分泌机制的研究

嗜盐古菌细胞通过Tat途径分泌折叠好的胞外蛋白质，可避免胞外苛刻的环境因子对蛋白质折叠造成不利影响，被认为是嗜盐古菌适应极端环境的一个重要策略。但是对蛋白酶而言，如果它们在胞内折叠好后通过Tat途径分泌，在分泌之前有可能释放活性降解胞内具有重要生物学功能的蛋白质，从而对细胞生长造成危害，嗜盐古菌胞外蛋白酶的分泌机制及细胞在其中所发挥的调控作用仍然是未解之谜。我们在前期工作中通过实验证实嗜盐古菌Natrinema sp. J7的一种胞外蛋白酶为Tat途径的底物，最近，J7菌株的基因组的测序工作已完成。在上述工作基础上，本项目以J7中具有Tat特征信号肽序列的5种胞外蛋白酶为研究对象，确定它们的分泌途径，阐明嗜盐古菌胞外蛋白酶分泌与活性释放的细胞调控方式，为揭示极端嗜盐古菌的蛋白质分泌机制及其适应机理提供新的理论依据。

我们首先完成了嗜盐古生菌Natrinema sp. J7-2全基因组的测定，J7-2是第一个完整测定基因组的Natrinema属菌株。Natrinema sp. J7-2的基因组由3,697,626-bp的染色体和一个95, 989-bp 的质粒pJ7-I组成。以往嗜盐古生菌基因组分析结果表明，尽管嗜盐古生菌同时具备Tat和Sec分泌系统，但它们广泛采用Tat 途径分泌胞外蛋白，这被认为是嗜盐古生菌在分泌机制方面不同于其他古生菌和细菌的独特之处。为了探究Tat和Sec分泌系统在嗜盐古生菌胞外蛋白分泌过程中的作用，我们在菌株J7-2基因组分析的基础上，利用RPLC-ESI-MS/MS质谱技术对该菌分泌的胞外蛋白和膜蛋白进行了研究。结果显示，通过质谱技术所检测到的分泌蛋白质的种类和数量远少于基因组的预测结果。总共检测到48个具Tat信号肽的蛋白（Tat底物），20个具Sec信号肽的蛋白（Sec底物）和3个III型分泌系统的蛋白，64%的Tat底物主要为具有Lipobox结构的脂蛋白，大多数为胞外溶质结合蛋白和氧化还原蛋白等。膜组分中的Sec底物主要为含有多个跨膜区的膜蛋白，这显示Sec信号肽在膜蛋白的定位过程中发挥重要作用。.我们将菌株J7-2的胞外蛋白酶SptA（Tat信号肽）和SptE（Sec信号肽）基因进行克隆和表达，并对这两种蛋白酶进行了信号肽替换以观察不同信号肽对这两个蛋白分泌的影响。结果表明：将SptA的Tat信号肽替换为Sec信号肽后，在重组菌培养物胞外上清及细胞表面均未检测到蛋白酶活性；当SptE的Sec信号肽替换为Tat信号肽后，在培养物细胞表面能够检测到蛋白酶活性。表明嗜盐古生菌的Tat系统不仅可以分泌折叠蛋白，也具有分泌去折叠蛋白的能力。我们也对SptA的成熟加工过程进行了初步研究。本工作为揭示极端嗜盐古菌的蛋白质分泌机制及其适应机理提供新的理论依据。