COX-1基因5'侧翼序列多态性对阿司匹林抗血小板作用的影响和阿司匹林抵抗关系的研究

Aspirin irreversibly acetylates the enzyme cyclooxygenase -1 in platelet, plays the key role of anti-arterial thrombosis and remains the cornerstone of the prevention and treatment of ischemic cardiovascular and cerebrovascular diseases.However, some patients is low response to aspirin therapy, known as aspirin resistance (AR).Mechanism of AR is not entirely clear.Therefore，treatment of AR is aimless.our Preliminary studies show that rs1330344 (-1676A / G) in COX-1 gene promoter region is associated with AR in Chinese elderly Han patients, which suggested that investigating COX-1 gene polymorphism in 5 'flanking and its binding -transcription factors is greatly important to diagnosis and treatment of AR.Thus,to identify transcriptional activity of SNPs in 5'flanking of COX-1,the methods of cloning and sequencing different fragment of 5 'flanking in COX-1 gene,constructing the pGL3 Luciferase reporter vectors are needed. To analyze putative binding sites of transcription factors in the regulatory region ,NNPP bioinformatics software, EMSA（electrophoretic mobility shift assay） will be used.Furtherly, relationship among AR ,SNPs in COX-1 5'-franking, and acetylated COX-1 protein in patients will be studied, and acetylated COX-1 protein will be identified by western blot.Finally,based on the above works, treatment of AR will be proposed and feasibility will be assessed via clinical intervention and follow-up.

阿司匹林通过不可逆地乙酰化血小板环氧化酶-1（COX-1）发挥抗动脉血栓的作用，是临床防治缺血性心脑血管疾病的基石。部分人群存在对阿司匹林治疗反应低下的现象，称为阿司匹林抵抗(AR)。AR原因不完全清楚，故AR是临床治疗的难点。前期研究显示COX-1基因启动子区rs1330344（-1676A/G）与中国老年汉族人群AR相关联，推测COX-1基因5'侧翼多态性及其转录因子的破译对AR的诊治意义重大。本课题拟采用COX-1基因5'侧翼序列测序、克隆包含相应SNP位点的片段、构建pGL3双荧光素酶报告载体来研究SNP的转录活性。利用NNPP等生物信息学软件预测转录因子，用凝胶迁移EMSA等方法加以验证。进一步用western blot 比较AR、SNP、患者血小板乙酰化COX-1三者的关系。揭示AR发生机制，提出AR治疗方案，并验证治疗方案的可行性。

临床上观察到部分人群存在对阿司匹林治疗反应低下的现象，称之为阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR），揭示AR发病机制是本课题研究的主旨。尽管AR发病机制不完全清楚，但是有证据显示AR在病因学上存在着一定遗传学基础，某些环境因素对AR表型会起到部分的修饰作用。然而，AR在临床上存在着临床AR与实验室AR双重概念，给研究的顺利进行带来了极大的困扰。临床AR指临床上发现阿司匹林用于缺血性动脉血栓事件的二级预防过程中，仍然有部分患者发生不良事件。实验室AR指实验室通过多种血小板功能学监测手段，发现某些患者服用阿司匹林后，在体外达不到充分抑制血小板聚集的作用，称为实验室AR。我们借助于遗传学上极端表型（extreme phenotype）的概念，认为真实的AR应该是二者的统一。本研究在具体实施中，分两个步骤完成，即临床研究部分和基础研究部分。首先就AR遇到的临床问题入手，对AR临床诊断、影响因素、AR远期预后观察等问题进行了深入研究。在临床研究的基础之上，将实验室AR和临床AR合二为一，筛查出接近真实的AR表型，并将34例AR患者，按照1：1性别和年龄匹配选择了相应的对照组，因血小板环氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）是阿司匹林在体内发挥抗血小板作用主要的靶蛋白之一，我们前期结果显示COX-1启动子区单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP） rs1330344与实验室AR具有相关性。据此在本课题中，我们对COX-1基因全长25kb及上游5 Kb的区域，总长约为30 Kb的基因进行克隆。结果显示：在AR表型水平上，AR受到诊断方法、阿司匹林剂量、慢性疾病状态等重要因素的影响。在AR遗传学水平上，初步研究结果表明COX-1基因第7888碱基处的SNP与AR具有一定的相关性。提示该位点，可能是真正与中国汉族人AR相关的COX-1基因位点，该位点既与实验室AR又与临床AR相关的特征，预示其可能对AR临床诊断、治疗及预测具有重要价值，其研究仍需进一步去深入。至目前为止，该课题在研究成果上发表论著7篇。