EEF1D对中国美利奴生长期次级毛囊真皮乳头细胞FGF5信号通路的影响及其对FGF5转录调控关系的研究

FGF5 is an important candidate functional gene for wool traits and has high breeding value. But the molecular mechanism of its action has not been proven. Our previous studies found that over-expression of EEF1D in sheep skin fibroblasts can markedly enhance the expression of FGF5 . We speculate that EEF1D possibly affect hair cycle in sheep by transcriptional regulation to FGF5 gene. To test this hypothesis, set Chinese Merino as study subject, this project intends to carry out the following research by technologies and methods of molecular biology, cell biology and bioinformatics: 1. Expression and location of EEF1D and FGF5 in hair follicle at different phase of hair cycle in Chinese Merino. 2. Culture of dermal papilla cells from secondary hair follicle (SHF-DPC) of Chinese Merino sheep. 3. Effects of over-expression and down-expression of EEF1D on FGF5 signaling in SHF-DPC in vitro. 4. Effects of EEF1D on the promoter activity of FGF5 gene and the identification of transcriptional binding sites. These research results would help to determine the transcriptional regulation relationship between EEF1D and FGF5 and its effect on sheep hair cycle, and further to verify the function of EEF1D and FGF5.

FGF5是影响羊毛性状的重要候选功能基因，具有较高育种价值，但其作用的分子机制仍未探明。前期研究发现，在绵羊皮肤成纤维细胞中过表达转录因子EEF1D可显著促进FGF5表达，推测EEF1D可能通过转录调控FGF5基因进而影响绵羊毛囊发育及羊毛生长。为验证这一假设，拟以中国美利奴为研究对象，采用分子生物学、细胞生物学和生物信息学技术与方法，研究EEF1D、FGF5基因在中国美利奴羊毛生长周期毛囊的表达和定位；分离培养羊毛生长期次级毛囊真皮乳头细胞（SHF-DPC）；研究EEF1D表达变化（上调或下调）对SHF-DPC中 FGF5信号通路的影响；研究EEF1D对FGF5启动子活性的影响，并通过凝胶阻滞实验鉴定FGF5基因启动子区域EEF1D转录结合位点。研究结果将为确定EEF1D与FGF5之间的转录调控关系及其对绵羊羊毛生长周期的影响，进一步验证基因功能提供理论依据，具重要研究价值和学术意义。

本项目执行期间，建立了中国美利奴（超细型）和哈萨克羊（粗毛羊）毛囊兴盛期皮肤组织的转录组文库并进行高通量测序，筛选出一批差异基因并进行了初步功能验证。对差异表达基因的克隆及组织表达分析结果表明，EEF1D基因在中国美利奴皮肤组织中呈高丰度特异性表达且在毛囊周期不同阶段有明显的表达变化，其在细毛羊和粗毛羊毛囊发育期的表达丰度均依次为休止期>生长期>退行期（P<0.05），EEF1D基因在细毛羊生长期和退行期的表达丰度均显著高于粗毛羊。以绵羊成纤维细胞为模型，初步验证了EEF1D对FGF5通路相关因子表达的影响。建立了高效便捷的绵羊毛囊真皮乳头细胞分离方法，并获得中国美利奴羊毛生长期毛囊真皮毛乳头细胞（CMS-DPCs）。在此基础上，研究了绵羊EEF1D 过表达对CMS-DPCs细胞中FGF5 及其信号通路中主要因子（IGF1、FGFR1、BMP4、NOG等）表达的影响。结果表明，CMS-DPCs中EEF1D基因过表达显著上调了细胞内IGF1和FGF5基因的表达，同时显著下调了FGFR1基因的表达，但对BMP4、NOG等基因的表达没有产生明显影响。结合已有报道，研究结果进一步验证了EEF1D可能通过调控FGF5通路相关因子FGF5、IGF1、FGFR1等基因的表达发挥诱导毛囊退行期作用的推测。研究结果为进一步确定EEF1D与FGF5之间的转录调控关系及其对绵羊羊毛生长周期的影响，验证基因功能提供了理论依据，具重要研究价值和学术意义。在本项目资助下，课题组还与国内外多家单位合作开展了新疆地方绵羊品种的全基因组扫描和遗传多样性研究，为揭示绵羊遗传分子进化和重要性状形成的分子机理提供了新的研究视野。