NSCs、BMSCs移植治疗锰中毒大鼠多巴胺能神经损伤分子机制研究

The main pathological mechanism of manganese poisoning and Parkinson's disease(PD) is dopaminergic nerve cells' damages. In this study, we intends to transplant human neural stem cells(NSCs) which are induced and differentiated from human embryonic stem cells(hES) and bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) to manganese poisoning rats. Observe the therapeutical effects of stem cell transplantation as well as investigate the role and molecular mechanism of α-Synuclein、neurofilaments、ubiquitin proteins and Tyrosine Hydroxylase(TH) in dopaminergic neuron injury induced by manganese poisoning through these experiments. The major contents of this research are as follows. Transplant NSCs and BMSCs to rats in order to investigate their therapeutical effects. Demonstrate that transplanted stem cells can differentiate normally into Tyrosine Hydroxylase positive neuron and protect and/or stimulate the regeneration of host's injured dopaminergic neurons by analyzing of dopaminergic neural cells' morphology and function. Comparatively analyse changes of gene expression profile of dopaminergic neurons to estimate and verify possible susceptible genes of manganese poisoning' rats. Through the above study, search for key genes and signal passways of dopaminergic neurons' phenotypic and functional changes so as to provide the trial basis for the clinical use of transplanting stem cells to treat manganese poisoning

多巴胺能神经细胞损伤是引起锰中毒及帕金森氏病（PD）的主要病理机制之一。本研究拟通过人胚胎干细胞（hES）诱导分化的神经干细胞(NSCs )和骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗大鼠锰中毒模型，观察干细胞移植对锰中毒神经损伤的治疗作用，探讨α-Synuclein、neurofilaments、ubiquitin proteins及TH在锰中毒引起的多巴胺能神经元损伤中的作用及分子机制。本课题主要研究内容：将NSCs和BMSCs移植入锰中毒大鼠体内，观察其治疗作用，通过分析多巴胺能神经细胞形态及功能，证实移植干细胞在大鼠体内分化为TH+神经元，并保护和/或刺激宿主损伤的多巴胺神经元再生；对比分析大鼠多巴胺能神经元的基因表达谱改变。通过以上研究寻找锰中毒引起多巴胺能神经元表型及功能改变的关键基因与信号通路，为干细胞移植治疗锰中毒的临床应用提供实验研究基础。

本研究拟探讨人源性骨髓间充质干细胞（BMSCs）、神经干细胞（NSCs）脑定位移植对锰中毒大鼠的治疗效果及机制，筛选锰中毒可能的突变或易感基因及代谢通路，为慢性锰中毒临床生物治疗提供实验依据。具体如下：（1）采用MnCl2 25mg/kg.ip.q48h.12w建立慢性锰中毒大鼠模型，以神经行为、肌张力、TH定量等变量为主，建立Fisher判别函数模型，该判别函数对锰中毒大鼠和非锰中毒大鼠准确判别的符合率分别达到100%和92.3%；（2）成功分离、培养、鉴定 BMSCs、NSCs，定位移植至大鼠右脑纹状体，观察移植后大鼠行为及DA神经功能相关指标变化4月；（3）利用NeuN/hNUC、TH/hNUC、VMAT2/hNUC三维荧光双标方法观察干细胞分化印迹，发现BMSCs及NSCs在大鼠脑内存活并逐渐向DA能神经元分化现象，电镜病理观察到其对锰暴露所致DA神经元损伤有一定修复作用；与对照组相比，干细胞移植组变性蛋白聚集现象相对稳定，说明干细胞移植对锰中毒导致的神经损伤有一定的阻遏作用，BMSCs较NSCs效果明显；（4）通过对DA含量、酪氨酸羟化酶（TH）及其他相关因子NeuN、 VMAT2、BDNF分析，发现BMSCs、NSCs移植后，可明显增加上述蛋白表达量（F=5.217、4.969、5.654、4.498、3.231，P <0.05），这种高表达作用移植后一个月表现较明显，以后呈缓慢下降趋势，结果从不同途径证实BMSCs、NSCs移植可增强慢性锰中毒大鼠多巴胺能神经功能。其中DA与TH明显相关（r=0.488，P<0.05），说明干细胞移植增加DA含量的机理之一，可能是通过上调TH而加快了酪氨酸向多巴的转化。（5）本课题率先对锰中毒大鼠脑纹状体进行全基因组分析，采用Illumina HiSeq检测平台，筛选差异基因17个，初步通过GO分析、Pathway功能分析确定基因功能，发现差异基因涉及PI3K- Akt、mTOR、FoxO等细胞凋亡相关通路以及谷氨酸代谢、神经活性受体-配体作用等。利用String数据库，观察差异基因的互作基因，推测HspB1、Rem2、Oprd1、ATF5、TRHr基因可能参与锰中毒致病机制。今后课题组将继续对差异基因功能进行深入研究。本项目拟申请发明专利1项，撰写论文10篇，已发表7篇，参加国内外学术交流5次，培养硕士研究生4名。