中脑黑质多巴胺能神经元损伤大鼠便秘发生机制的研究

几乎所有帕金森病（PD）患者都经历有胃肠动力障碍的临床表现如：胃食管返流、胃轻瘫和便秘等，这些症状的出现往往先于PD典型的躯体运动障碍很多年，但发生机制不明。我们前期研究发现：用6-OHDA毁损黒质多巴胺能神经元的大鼠表现有明显的便秘；其结直肠交界处紧张性显著增强，肠神经系统（ENS）中氮能和VIP能神经元数量明显减少。我们猜测：黒质多巴胺能神经元损伤可能通过植物神经系统影响不同肠段神经递质的释放，导致肠平滑肌功能异常，粪便通过困难、排便反射减弱，致使便秘发生。本项目通过制备脑-肠多巴胺缺失及局部交感神经或盆神经切断等动物模型，深入研究脑-肠多巴胺及其受体对结肠运动的调节，植物神经通路和ENS在中枢多巴胺缺失所致结、直肠运动紊乱中的作用，从而揭示脑-肠多巴胺、植物神经通路和ENS与PD便秘的关系，为PD病人便秘发生的机制和诊治，以及 PD早期/前期生物标志物的筛选提供理论和实验依据.

便秘是帕金森病最常见的胃肠道症状之一，且往往先于运动系统功能障碍前一二十年出现，目前因其发病率高、严重影响患者的生活质量而备受关注。前期研究发现用六羟多巴（6-hydroxydopamine，6-OHDA）损毁双侧黑质的PD模型大鼠（6-OHDA 大鼠）表现出明显的便秘现象，但是机制不清。本研究通过观察对照组和6-OHDA大鼠结肠的动力、肠神经递质和相关受体的变化深入探讨其便秘发生的可能机制。采用Power lab生物信号采集记录系统和四腔器官浴槽系统研究在体/离体大胃结肠的自发收缩活动；通过免疫荧光和蛋白免疫印迹检测神经元和受体在结肠的分布和表达；通过超高效液相色谱-质谱分析联用法（Ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC/MS/MS）测定结肠神经递质的含量。研究发现：6-OHDA大鼠黑质致密部酪氨酸羟化酶免疫阳性神经元的数量明显减少，运动协调性变差，每天的排便粒数、粪便干重和含水量均明显降低；6-OHDA大鼠结直肠（DC1段）的动力指数明显增强，且高于自身的远端结肠（远离结直肠交界5厘米为DC4段），与对照大鼠DC1段动力指数低于DC4段的现象恰恰相反；而6-OHDA大鼠DC4段肌层的DA含量明显升高，NE和5-HT含量却无明显变化，该部位D5受体和5-HT4受体蛋白水平降低，而β3受体蛋白含量却明显上调，提示肠道单胺类递质和受体的改变可能参与了6-OHDA便秘的发生。此外，6-OHDA大鼠乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶的表达在DC1和DC4段均显著减少；毒蕈碱M1受体在6-OHDA大鼠结肠的DC1和DC4段均明显降低，然而M2和M3受体在DC4段降低，在DC1段却明显升高，同时6-OHDA大鼠DC1段对M受体激动剂氯贝胆碱的反应性增强，提示：肠道胆碱能系统改变可能与6-OHDA大鼠结肠不协调收缩有关。结论：6-OHDA模型大鼠DC1段动力增强，DC4段动力减弱这种不协调收缩会阻碍粪便通过，可能是其便秘发生的重要因素。而单胺类递质和受体，胆碱能系统的变化可能是其不协调收缩的重要原因。本研究为临床PD病人便秘的早期诊断和治疗提供了理论和实验室依据。