Fli-1通过抑制Smad3转录促进肝癌发生的机制研究

Smad3 that plays a critical role in tumorigenesis of Hepatocellular Carcinoma (HCC) as a tumor suppressor. Our previous research has revealed that Fli-1 interact with Smad3 and inhibit the transcription of Smad3. More important, the expressive level of Fli-1 is increased in hepatitis, Cirrhosis and HCC tissue. In the study of cell biological function we have found that Fli-1 promotes cell proliferation in HCC cell line. These findings suggest that Fli-1 may promote HCC formation. Thus, this project is to analyze the correlation of Fli-1 and HCC formation and prognosis in clinical level, detect the effect of Fli-1 on cell growth, cycle, apoptosis and migration in cell level, reveal Fli-1 promotes the occurrence of HCC through the TGFβ/Smad signaling pathway by inhibit the transcription of Smad3 in molecular level with the analysis of breast samples and molecular biological methods. Furthermore, we will establish an hepatitis-HCC mice model induced with carcinogens of DEN to investigate the effects and molecular mechanisms of Fli-1 on HCC formation. Through all the above efforts, we might find a new regulation mechanism of HCC and provide a new potential target for HCC treatment.

Smad3在肝癌的发生阶段发挥抑癌的重要作用，我们的前期工作发现 Fli-1与Smad3存在相互作用，并能显著抑制Smad3的转录。更重要的是，在人的肝炎、肝硬化及肝癌的临床样本中Fli-1的表达水平呈递增趋势，初步细胞生物学功能研究发现Fli-1具有促进肝癌细胞增殖的作用。这提示Fli-1可能促进肝癌的发生。本项目拟在此重要线索基础上，通过临床样本分析结合分子生物学手段，于临床水平分析Fli-1与肝癌发生及预后的相关性，于细胞水平检测Fli-1对肝癌细胞生长、周期、凋亡及迁移的影响，于分子水平阐明Fli-1通过抑制Smad3转录进而调控TGF-β/Smad信号转导通路促进肝癌发生的分子机制，并进一步利用致癌剂DEN诱导小鼠发生肝炎-肝癌动物模型，于体内水平研究Fli-1对肝癌发生的影响及分子机制。通过以上努力将可能发现新的肝癌发生调控机制，同时也将为其治疗提供新的潜在靶点。

本项目基于前期工作基础，按拟定方案完成了Fli-1在肝癌发生发展中的作用及机制研究。首先我们收集了73例肝癌样本，完成了Fli-1免疫组化的检测并分析了其与肝癌临床特征的关系，结果表明Fli-1的肝癌组织中的高表达，分析其对预后的影响发现，高表达Fli-1的患者均预后较差，无病生存期明显缩短。为了系统性研究Fli-1对肝癌细胞生物学功能的影响，我们设计了Fli-1小RNA干扰序列，并在肝癌细胞系HepG2里建立Fli-1稳定干涉细胞模型。利用细胞模型继续研究Fli-1的功能，我们发现Fli-1可以明显抑制细胞凋亡，并且Fli-1的表达可以促进细胞的克隆形成能力，均表明Fli-1发挥促癌基因的功能。此外，我们在研究过程中意外发现了Fli-1与HBV DNA高复制密切相关，这为肝炎-肝癌的发生发展提供了一条新的线索。我们前期工作检测到Fli-1与TGF-β信号通路中的重要蛋白Smad3存在相互作用，我们通过荧光素酶报告载体来检测Smad3的活性，结果显示，过表达Fli-1可以明显抑制Smad3的活性，并且呈剂量依赖性。进一步验证Fli-1对Smad3蛋白及磷酸化水平的影响，结果显示，TGF-β刺激下，过表达Fli-1后，不影响Smad3蛋白的本底水平，但明显抑制Smad3磷酸化水平。而在HepG2细胞中下调Fli-1的表达，加入TGF-β刺激后同样不影响Smad3蛋白的本底水平，但Smad3的磷酸化水平明显增高。Smad3直接调控的下游靶基因包括Beclin1，TIMP-，DAPK，FOXA2等，我们应用RT-PCR的方法验证了Fli-1对smad3下游的靶基因的表达亦发挥调控作用。为了验证Fli-1的体内效应，我们应用已构建的Fli-1稳定干涉细胞株来进行裸鼠成瘤实验，结果显示，干涉Fli-1后形成的肿瘤无论在大小还是时程上都明显弱于对照组，表明Fli-1可以明显促进成瘤能力，进一步于体内水平证明Fli-1的促癌基因功能。因此，本研究以肝癌为模型，通过临床样本分析结合细胞生物学功能实验明确Fli-1具有促进肝癌恶性表型的功能，并为肝癌的预后提供了新的生物标记物。通过研究Fli-1 抑制Smad3转录进而参与调控TGF-β/Smad信号通路的机制，阐明Fli-1促进肝癌发生的分子机制。这些问题的解决将为肝癌的发病机制提供理论基础，为肝癌的分子靶向治疗提供新思