利用具有不同分化特性的骨髓间充质干细胞单细胞克隆构建组织工程支架进行先天性显性脊椎裂治疗的研究

在前期研究基础上，我们成功建立了胎仔外科和显微注射相结合的技术，将骨髓间充质干细胞（MSCs）移植到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓缺损区域，结果发现MSCs可以分化为不同的神经细胞，而且能够分泌神经营养因子减少周围神经细胞凋亡，为进一步研究先天性脊椎裂产前治疗提供了新的思路。但是由于缺损部位的组织较少，注射后能够存留的细胞数量有限，虽然移植后分化率较高，但细胞成活率却较低，因此，本课题将分离并筛选具有向神经细胞、软骨细胞和表皮细胞特异性分化的MSCs单细胞克隆，利用这三种单细胞克隆构建复合双层可吸收支架，然后对先天性脊椎裂胎鼠进行移植。这样不仅解决移植细胞数量不足问题，而且可以对神经、骨骼和皮肤缺损进行针对性的修复，并根据干细胞迁移、分化和建立神经突触连接的情况，以及组织缺损修复和后肢功能恢复的情况，确定先天性脊椎裂产前治疗的最佳时间点和最佳治疗策略，也为其它先天畸形的产前治疗提供新方法。

在前期研究发现先天性脊椎裂胎鼠的脊髓运动、感觉神经元存在明显的发育异常的基础上，本课题提出利用干细胞移植重建治疗脊椎裂的新思路，经过一段时间的不断摸索和显微操作技术的训练，本课题成功建立了胎仔外科、显微外科和显微注射相结合的胚胎期干细胞移植技术。利用维甲酸灌胃致畸的方法建立先天性脊椎裂动物模型，同时利用胎仔外科、显微外科和显微注射相结合技术，将GFP转基因标记的骨髓间充质干细胞分别移植到脊椎裂胎鼠的病变脊髓处，结果发现多数绿色荧光标记的干细胞可以在病变的脊髓内存活，并可分化为不同的神经细胞。为了探讨局部脊髓组织微环境对移植骨髓间充质干细胞的影响,本课题利用定量PCR方法对骨髓间充质干细胞移植后先天性脊椎裂局部脊髓组织的神经营养因子和生长因子的表达变化情况进行研究,共检测VEGF, FGF 4, FGF 2, FGF 8, FGF 10, FGF 20, FGF 7, EGF, IGF, TGF-α, TGF-β和PDGF等12种因子，结果发现EGF, FGF 2 和FGF 20的表达量与干细胞存活数量有明显相关性，表明EGF, FGF 2 和FGF 20可能对于移植干细胞的存活和迁移有关。移植的骨髓间充质干细胞在局部脊髓组织内不仅自身表达神经营养因子，而且可以诱导周围组织细胞表达神经营养因子，通过凋亡检测发现移植骨髓间充质干细胞周围的细胞凋亡明显减少，并发现骨髓间充质干细胞通过抑制Caspase3表达来减少神经元凋亡。 利用明胶-壳聚糖多孔支架/纤维蛋白胶支架相结合制备复合组织工程支架，对支架的性质表征测定，同时利用骨髓间充质干细胞作为种子细胞观察其在支架中生长与分化情况。将骨髓间充质干细胞作为种子细胞构建复合组织工程支架，然后在胚胎16天，利用胎仔外科手术技术将支架移植在先天性脊柱裂胎鼠的脊髓组织缺损部位，待胎鼠生长到20天时剖腹取出接受支架移植治疗的胎鼠，观察支架对脊髓缺损部位修复、支架降解和骨髓间充质干细胞分化等情况，结果发现接受支架移植的胎鼠脊髓缺损部位明显修复，利用组织切片免疫荧光染色技术发现骨髓间充质干细胞存活良好而且部分细胞已分化为神经细胞，支架部分降解。表明携带骨髓间充质干细胞的组织工程支架对于先天性脊柱裂的脊髓组织缺损具有明显修复作用，是非常有前景的治疗方法。本课题培养研究生6名，发表论文10篇。