CERKL调控TRX2，保护视网膜细胞抗氧胁迫引起的凋亡

Cone photoreceptors death is the last stage for human diseases lead to blindness, including retinitis pigmentosa (RP),cone-rod dystrophy(CRD),and age-related macular degeneration (AMD). Mutations in ceramide kinase-like (CERKL)gene, was identified to cause RP/CRD,however,the mechanisms underlying cone and rod death in the patients habour CERKL mutation remains unclear. Supporeted by the last NSFC grant, we obtained some important results:By using yeast-two hybridization screen and confirmed by Co-IP and GST pull-down assay, we found that CERKL may interact with thioredoxin-2 (TRX2), a mitochondria protein, which is critical regulators of reduction-oxidation (redox) balance in cells; Knockdown of CERKL in zebrafish leads to cone-rod dystrophy like phenotype with strong signs of oxidative damage. Therefore oxidative stress and increases in ROS are believed the reason of photoreceptor cells death caused by CERKL mutation. In this investigation, we will perform in vitro and in vivo studies, to identify the critical domains for the interaction betwen CERKL and TRX2,elucidate the physiologic and pathologic implication for the interacton. Our studies will not only find a mechanistic explanation of how mutations in CERKL may lead to photoreceptor death, but also provide potentially new targets to overcome cone cell death in a broad category of inherited and age-ralated retinal degenerations.

视锥细胞死亡是包括视网膜色素变性、视锥视杆萎缩及黄斑变性等人类致盲的最终途径。CERKL突变可导致视网膜变性，但其突变引起视锥及视杆细胞死亡的机制一直未能取得重要进展。前期我们通过酵母双杂交、Co-IP，GST pull-down实验，发现CERKL和TRX2相互作用；用morpholino抑制CERKL表达，导致斑马鱼出现视网膜变性表型，并可在感光细胞中观察到显著的ROS损伤信号，提示CERKL缺陷可丧失其清除ROS功能，可能是CERKL突变致病的病理基础。本项目将通过体外实验和斑马鱼体内研究，确定CERKL和TRX2相互作用的结构基础，CERKL调控TRX2进而抗氧化导致的细胞凋亡的具体生化机制及其生理学意义。本项目不仅将有望首次揭示CERKL突变导致视网膜变性的分子机制，而且对于理解视锥细胞死亡机制，发展有效的针对RP/CRD/AMD等的预防和治疗方法具有重要学术价值和应用前景。

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一类以视网膜感光细胞退行性死亡为特征的遗传性视网膜变性疾病，是遗传性视觉损伤和失明的最主要的原因之一。CERKL基因是一个重要的的视网膜变性致病基因，其突变可引起视网膜色素变性和视锥视杆营养不良，但国内外对CERKL在视网膜中的生理功能研究一直未能取得重要进展，其突变引起视网膜变性的病理机制还不清楚。.在国家自然科学基金项目的支持下，我们应用生物信息学、遗传学、细胞生物学、生物化学等方法，以及模式生物为手段，对CERKL在视网膜中的生理功能进行了深入系统地研究，取得了一些重要的突破性进展。应用酵母双杂交、免疫共沉淀等实验技术，首次发现并确定了CERKL与线粒体硫氧还蛋白TRX2存在直接相互作用。进一步分析这种相互作用的生理意义，发现CERKL能够调控TRX2氧化还原状态，保护细胞免受由氧化压力引起的细胞凋亡。应用Morpholino抑制斑马鱼CERKL的表达，发现斑马鱼中出现明显的类似于视网膜变性症状，包括视网膜感光细胞层明显变短，感光细胞排列紊乱，TUNEL结果显示视网膜的多个细胞层中均呈现明显的细胞凋亡信号等。在CERKL敲降的斑马鱼视网膜组织中，核酸、蛋白、脂类这些生物大分子都发生了明显的氧化损伤信号，提示CERKL通过调控TRX2，保护视网膜细胞抵抗氧胁迫引起的细胞凋亡。研究CERKL在视网膜维持稳态的机制，我们首次发现CERKL和pVHL相互作用，pVHL可以通过ECV复合体泛素化CERKL，从而在蛋白水平上调控CERKL的稳态。发现CERKL通过缺氧应答通路PHD1/3-pVHL感知外界胁迫，首次阐释了CERKL感应外界胁迫（ROS，缺氧和代谢压力等）的分子机制。我们还应用TALEN技术，成功地在斑马鱼中敲除CERKL基因，对基因敲除斑马鱼进行组织学观察，确定CERKL基因突变导致斑马鱼呈现视网膜色素变性，而非视锥视杆营养不良症状。这是世界上建立的唯一的CERKL基因突变引起视网膜色素变性的动物模型。我们的研究世界上首次揭示了CERKL在视网膜感光细胞中通过TRX2保护细胞抵抗氧胁迫的信号通路，首次明确了在斑马鱼中该基因突变引起的视网膜变性的病理过程。这些重要研究成果的取得，不仅为进一步阐明视网膜变性的病理机制，也为发展针对该基因突变引起的视网膜色素变性的预防和治疗方法，打下了扎实的基础。