应用电子顺磁共振方法揭示膜铁转运蛋白的动态转运机制

Electron paramagnetic resonance (EPR), a method that can mark the proteins after purification, is suitable for analyzing the dynamic conformation changes of transporters, especially eukaryotic transporters. In this proposal, we are trying to determine the conformation changes of ferroportin in response to iron transfer in membrane or membrane-mimic environments, using the EPR instrument in Stable High Magnetic Field Facility. As the sole iron exporter known in vertebrates to date, ferroportin plays important roles in iron balance maintenance, development and immunoreaction. Successful implementation of this project will obtain information of iron or hepcidin-induced ferroportin conformation changes, which in turn provide structural and dynamic evidence for drug design using ferroportin as target, and shed light on dynamic analysis of other transporters.

膜蛋白动态特性是其行使特定生理功能的物质基础。电子顺磁共振方法由于能在蛋白纯化后进行电子自旋标记，因而能有效揭示转运蛋白（特别是真核转运蛋白）将不同物质跨膜转运过程中的构象变化及动态机制。本项目将应用稳态强磁场设施高场电子顺磁共振设备，在细胞原位（或类似膜环境下）对膜铁转运蛋白（维持机体铁稳态的重要蛋白）转运金属离子及受激素调控时的动态构象变化进行检测：在膜铁转运蛋白不同位点引入电子自旋探针标记，分析该位点的电子自旋共振信号及双标记位点之间的距离变化，以揭示其构象变化和动态机制。并借助荧光成像和细胞生物学方法验证膜铁转运蛋白的动态机制。本项目的顺利开展，能够揭示膜铁转运蛋白在跨膜转运及受调控过程中的构象变化及动态转运机制，为进一步以膜铁转运蛋白为靶点的药物设计提供结构及动态构象依据，同时为其他跨膜转运蛋白的动态转运机制研究提供切实可行的方法依据。

在蛋白质结构与功能研究中，随着越来越多蛋白质结构被解析，对蛋白质动态特性的研究也受到关注。荧光物质对于周围微环境变化反映灵敏，荧光寿命检测相对荧光强度检测受到散射、漂白的影响较小，是一种非常实用的蛋白动态变化检测手段。同时，由于荧光的高灵敏性，除了能在蛋白纯化后进行标记外，还能够实现细胞原位检测。本项目在哺乳动物细胞上通过膜铁转运蛋白FPN-eGFP的荧光寿命检测，探究了活细胞功能状态下蛋白质的动态构象变化；通过荧光非天然氨甚酸标记和半胱氨酸突变，实现纯化蛋白的位点特异性双荧光探针标记和基于荧光寿命的距离测量。这些工作提示荧光寿命检测可作为电子顺磁共振方法研究蛋白质动态构象变化的有力补充。同时在探究过程中发现细胞自发荧光寿命与细胞代谢水平的关系，进一步拓展了荧光寿命成像检测的应用范围。在获得高表达纯化膜蛋白的基础上，通过在膜铁转运蛋白不同位点引入荧光和电子自旋探针标记，分析该位点的信号及双标记位点之间的距离变化，揭示在其进行离子转运时包括C端在内的多个位点发生了构象变化。这为更多跨膜蛋白的动态功能机制研究提供可行的方法依据。