特异性抑制免疫系统中重要钾离子通道Kv1.3的蝎毒素筛选、结构测定和功能分析

Voltage-dependent potassium channels are critical for maintaining membrane potentials in both excitatory and non-excitatory cells. In immune cell, Kv1.3 channels participate in lymphocytes activation through modulation of calcium signaling. Since Kv1.3 channel blockage on the membrane controlled the effector memory T (TEM)-cells in autoimmune diseases, toxins targeting Kv1.3 channels with high affinity and high selectivity are important for suppressing the TEM cell-mediated autoimmune disease. We are planning to search for high selective Kv1.3-blocking toxins from scorpion venom. Combined methods including molecular biology, patch-clamp, solution NMR and fluorescence are used to explore the structure of the toxins, the interaction surface and the mechanism of toxin blocking Kv1.3 channels. The clarity of this mechanism may lead to better understand of different affinity of toxins on to different Kv1.x channel family member, as well as better design of high affinity and high selectivity Kv1.3 blockers for treatment of autoimmune diseases.

钾离子通道在可兴奋和非兴奋性细胞中均承担着调控细胞膜电位的重任。在免疫细胞中，Kv1.3通道通过调控膜电位及下游钙信号参与淋巴细胞激活，阻断Kv1.3通道会影响效应记忆T细胞(TEM)活动，是自身免疫性疾病重要的药物作用靶点。因此，获取Kv1.3通道高亲和性、高特异性的抑制剂，对研究药物与Kv1.3相互作用的分子机制及研制自身免疫性疾病的低副作用药物是关键。本项目从热带雨林蝎子的毒液多肽中筛选针对钾离子通道特别是Kv1.3通道的特异性抑制剂，并综合应用分子生物学、膜片钳、核磁共振、荧光等手段研究毒素多肽的三维结构、抑制Kv1.3通道的作用界面及作用的分子机制。本项目的执行，将能够更好地理解毒素多肽的不同结构对Kv1.x家族各成员亲和性高低的影响，并为进一步开发和改造应用于自身免疫性疾病治疗的Kv1.3高特异性毒素多肽提供坚实的研究基础。

天然有毒动物毒腺能够分泌多种活性物质，其中的多肽类物质由于具有一定三维结构，在结合靶蛋白时具有亲和性好、特异性高的特点，是靶蛋白相关疾病药物开发的先导分子。在免疫细胞中，Kv1.3钾离子通道通过调控膜电位及下游钙信号参与淋巴细胞激活，阻断Kv1.3通道会影响效应记忆T细胞(TEM)活动，是自身免疫性疾病重要的药物作用靶点。因此，获取Kv1.3通道高亲和性、高特异性的抑制剂，对研究药物与Kv1.3相互作用的分子机制及研制自身免疫性疾病的低副作用药物是关键。本项目从热带雨林蝎子及其他有毒动物的毒液多肽中筛选针对钾离子通道特别是Kv1.3通道的特异性抑制剂，获得了4条对Kv1.3通道起效的活性肽序列。应用分子生物学、核磁共振、荧光和单颗粒冷冻电镜等手段，我们获得了活性多肽、Kv1.3/Kvβ2离子通道蛋白以及复合物的三维结构，活性多肽的三维结构为经典的α-KTx结构，Kv1.3离子通道结构为经典的四重对称结构。在此基础上进一步揭示了活性多肽结合Kv1.3的相互作用界面以及抑制Kv1.3通道的可能的分子机制，Kv1.3孔道区域的G427与H451位点在相互作用中起关键作用，并提示活性多肽结合可能与通道C型失活相关。同时，通过对活性多肽二硫键的改造，延长了多肽在血浆中的半衰期，为进一步开发和改造应用于自身免疫性疾病治疗的Kv1.3高特异性毒素多肽提供研究基础。在活性多肽筛选过程还发现了一系列针对其他疾病或药物靶点的功能性多肽，包括新型促修复活性多肽，抗痛风肽类药物先导分子，在缺血性中风中起神经保护作用的多肽分子等，对这些活性多肽分子的研究为进一步了解天然有毒动物活性多肽的作用提供了更多特异性序列和功能信息。