囊泡分选蛋白VPS33B在血小板α颗粒形成中的机制研究

Platelet is the major effector cells during thrombosis process, which releases kinds of granule contents involved in a variety of important pathophysiological processes. α-granule, as the primary granule in platelet, carries more than 200 kinds of proteins. The progress of granule biogenesis is the important step to determine whether the contents can be properly carried. But little is known about the mechanisms and formation process of platelet α-granule. Mutations in VPS33B lead to platelet α-granule deficiency. In our previous experiments, some proteins interacting with VPS33B were screened out using immunoprecipitation in combination with MS method, including VIPAR, NBEAL2 and Rab protein family, but the specific mechanism of interaction of these proteins is unclear. In this study we will expound the formation mechnism of VPS33B protein in platelet α-granule with animal model and in cells level (MEG01 cells and HEK293T cells), respectively: using immunoprecipitation and western blot methods to validate the proteins interacting with VPS33B; using fluorescent confocal microscopy to determine intracellular localization of these proteins; using the shRNA technology to specificly knock out a certain protein to observe the intracellular localization of other related proteins; megakaryocytic / platelet VPS33B conditional knockout mouse model was adopted to evaluate the influence of platelet α-granule deficiency during haemostasis and thrombostasis process in vivo, through a series of platelet function tests and thrombus model analysis. All these results are contributed to elucidate the mechanism of platelet α-granule formation and will provide a theoretical basis for elaborating the pathogenesis of platelet α-granule deficiency.

血小板颗粒内容物的释放参与多种重要的生理病理过程，内容物能否正确运载取决于颗粒的正确形成，α颗粒作为主要运载体，目前对其形成过程及机制了解甚少。VPS33B异常可导致α颗粒缺失。我们用免疫沉淀结合蛋白质谱筛选出多种可能存在相互作用的蛋白，包括VIPAR、NBEAL2和Rab蛋白家族等，但它们的具体作用机制尚不明确。本研究拟分别从细胞和动物水平阐述VPS33B蛋白在α颗粒形成中的作用机制：通过免疫沉淀和蛋白印迹方法验证与VPS33B相互作用蛋白并结合荧光共聚焦显微镜确定这些蛋白胞内定位；采用shRNA技术特异性敲除某种蛋白，观察其他相关蛋白的胞内定位；构建巨核系/血小板VPS33B条件敲除小鼠，通过系列血小板功能试验和诱导止血发生实验在体评价血小板α-颗粒缺失对凝血过程的影响。结果有望揭示血小板α-颗粒形成的细胞生物学机制，为阐述血小板α-颗粒异常疾病发病机制提供理论基础。

血小板颗粒内容物的释放参与多种生理病理过程，内容物能否正确运载取决于颗粒的正确形成，α颗粒作为主要运载体，目前对其形成过程及机制了解甚少。ARC综合症是一种常染色体隐性遗传性疾病，表现为关节挛缩、肾功能衰竭以及血小板α-颗粒内容物的缺失，研究表明Vps33b基因突变是导致这个疾病发生的分子机制之一，因此我们推测Vps33b蛋白可能参与了α-颗粒的形成。在本研究中，我们选用HEK293T和Meg01细胞作为研究工具，利用蛋白质谱和免疫共沉淀的方法，确定了VIPAR、Sec22b和α-tubulin与 Vps33b蛋白存在相互作用，并通过构建表达Vps33b不同截短体蛋白结合免疫沉淀，发现Vps16b与全长的Vps33b蛋白结合，而α-tubulin和Sec22b则分别与Vps33b中的两个Sec-1片段结合。Confocal结果显示，在分化的Meg01细胞生成前血小板的向外延伸的神经突触样细丝中，Vps33b复合物呈现出细丝状分布，vWF阳性囊泡与Vps33b复合物存在明显的共定位现象，提示Vps33b参与了血小板α-颗粒的运输。我们分别构建了全身性Vps33b基因敲除小鼠、巨核系/血小板特异性Vps33b基因敲除小鼠以及他莫昔芬诱导的造血干细胞Vps33b基因敲除小鼠三种模型，结果发现Vps33b基因纯合缺失的小鼠存在胚胎早期致死性；在对巨核系/血小板特异性Vps33b基因敲除小鼠的血小板进行检测时，发现Vps33b蛋白仅有部分被敲除，血小板α-颗粒的形成以及血小板相关功能仍未受到影响；但当我们对造血干细胞Vps33b基因敲除的小鼠血小板进行检测时发现Vps33b蛋白被完全敲除，并表现为α-颗粒的缺失和相关聚集功能受损，并且发现Vps33b蛋白的产生阶段早于巨核细胞的发生。为了进一步证实Vps33b复合物参与血小板α-颗粒的形成，我们通过分离胎肝诱导分化原代巨核细胞，分别观察Vps33bfl/fl-Scl-Cre-和Vps33bfl/fl-Scl-Cre+小鼠巨核细胞不同分化阶段的vWF阳性囊泡（作为α-颗粒的指示标记）和α-tubulin的定位情况，发现Vps33b蛋白敲除的巨核细胞在分化阶段存在vWF阳性囊泡向远端运输障碍，vWF阳性囊泡均滞留在巨核细胞胞滞留在巨核细胞胞浆内，揭示Vps33b蛋白可能是通过与α-tubulin的结合参与α-颗粒在胞内的运输。