重组人内抑素促进兔耳增生性瘢痕成纤维细胞转归作用的机制研究

研究认为，增生期瘢痕病理进程中表现为大量血管增生，类似肿瘤内新生血管的形成，因此，用于治疗肿瘤的血管形成抑制剂理论上可用于增生性瘢痕(HS)的治疗。内抑素是一种强效内源性血管生成抑制因子，可特异性抑制新生血管内皮细胞增殖，并诱导其凋亡，具有广谱抗肿瘤效应且未发现明显毒副作用。我们在前期初步观察重组人内抑素对兔耳HS有治疗作用的基础上,试图(1)采用兔耳HS模型，进一步观察重组人内抑素的抗HS作用；(2)体外培养增生性瘢痕成纤维细胞(HSFs)，观察重组人内抑素对其增殖与凋亡的影响；(3)观察重组人内抑素对HSFs细胞周期及增殖与凋亡相关基因表达的影响,了解其作用的细胞、分子机制和某些信号转导途径；(4)观察重组人内抑素对HSFs跨膜K+电流及胞内Ca2+稳态的影响，进一步了解其作用的始动环节和关键因素。为HS防治提供新策略，为寻找HS药物治疗新靶点提供实验依据，具有重要科学意义和研究价值。

病理性瘢痕在临床上可分为增生性瘢痕(HS)和瘢痕疙瘩两种类型，其中，HS是皮肤创伤后组织过度修复引起的皮肤纤维化疾病，手术后发病率可达40%-70%，烧伤后高达91%，临床上常会发生瘢痕性挛缩，可造成关节严重功能障碍。目前HS确切病因及发病机制尚未完全明确，临床上还缺乏特异性治疗措施，单纯手术切除未能达到控制瘢痕生长、防治复发的目的，且手术本身有可能导致新的瘢痕增生。因此，寻找疗效彻底且副作用少的药物治疗方案是研究病理性瘢痕防治的热点课题之一。内抑素是一种强效内源性血管生成抑制因子，有关其研究主要涉及其抗肿瘤活性与机制等。本研究观察重组人内抑素(rhEndostatin)对兔耳创面瘢痕增生、胶原沉积、生长因子表达、微血管形成、增生性瘢痕成纤维细胞(HSFs)增殖和凋亡、HSF细胞周期、细胞周期和凋亡相关基因、HSFs内Ca2+浓度的影响，探讨其作用的部分细胞及分子机制。结果发现：rhEndostatin(2.5, 5 mg/ml)可呈剂量依赖性抑制兔耳创面瘢痕增生；降低组织内I、III型胶原表达；抑制VEGF及TGF-β1蛋白表达、增加bFGF蛋白表达水平；抑制瘢痕微血管形成；rhEndostatin(12.5, 25, 50, 100 μg/ml)可抑制体外培养的HSFs增殖(P< 0.05, P< 0.01)，并呈现一定的量效和时效关系，IC50浓度为100 μg/ml；2.5 mg/ml及100 µg/ml rhEndostatin分别能引起组织内及体外培养的HSFs凋亡；rhEndostatin(100 µg/ml)作用于细胞48小时后，可引起HSFs G1期阻滞；降低p53, p27, cyclinD1, CDK4, PCNA, c-fos, c-jun, bcl-2, Fas, NFκB, caspase-3 mRNA和蛋白表达水平；促进HSFs胞外Ca2+内流，引起胞内Ca2+超载。其中，c-fos, c-jun, cyclinD1, CDK4和PCNA基因表达水平降低可能与HSFs细胞周期G1期阻滞有关，NFκB及Bcl-2基因表达水平降低及胞内Ca2+浓度([Ca2+]i )升高被认为是rhEndostatin促进HSFs凋亡的作用机制之一。该研究为HS的药物治疗及寻找其治疗新靶点提供实验依据，具有重要的科学意义和研究价值。