鸭疫里默氏杆菌脂多糖的结构分析与分子致病机制研究

Riemerella anatipestifer is a Gram-negative, non-spore-forming, non-motile, rod-shaped bacterium, it belongs to the genus Riemerella in the family Flavobacteriaceae. R. anatipestifer infection is a contagious disease of ducks, goose, turkeys and various other birds, and has caused the highest mortality among duck diseases. Lipopolysaccharide (LPS) is the major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria, contributing greatly to the structural integrity and pathogenesis of the bacteria. It comprises three parts of lipid A, core oligosaccharide and O-antigen. LPS has been determined as an important virulence factor of Gram-negtive bacterium. Up to date, no structural analysis and pathogenesis study has been reported for the LPS of R. anatipestifer. This study includes:(1) Isolation and structural analysis of LPS of R. anatipestifer strain CH3. (2) Whole genome sequencing of R.anatipestifer strain CH3. (3) Determination of the genes related to the synthesis of LPS, based on the LPS structure and whole genome sequence of the strain; Construction and biological characteristics of the LPS mutants of R. anatipestifer. (4) Pathogenesis studies of the mutants on host animals. (5) Transcription and expression analysis of the genes encoding cytokine proteins on monocytes/macrophages cells stimulated with LPS or whole cell bacteria (inactivated or live). (6) Clarify the role of R. anatipestifer LPS on the molecular pathogenesis of the bacteria. This study will benefit for the future prevention and control strategies against the infection.

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是一种革兰氏阴性、无芽孢、不运动的小杆菌。RA感染可引起鸭、鹅、火鸡等的高致病性、接触传染性疾病。细菌脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组分之一，由类脂A，核心多糖和O-特异性多糖三部分组成。研究表明, LPS是革兰氏阴性菌的一种重要的毒力因子。目前国内外对于RA LPS的分子结构以及分子致病机制的研究仍为空白。本研究的主要内容包括：1：RA菌株CH3 （CH3） LPS的分离纯化和结构测定；2：CH3的全基因组序列测定；3：CH3 LPS合成相关基因的鉴定、突变株的构建和生物学特性测定；4：突变株对易感动物的致病性差异分析；5：突变株LPS或全菌刺激单核/巨噬细胞后细胞因子编码基因的转录及表达差异分析。6：阐明RA LPS的分子致病机制。该研究将为RA的预防和控制提供理论基础

背景：鸭疫里默氏杆菌（RA）是一种革兰氏阴性、无芽孢、不运动的小杆菌。RA感染可引起鸭、鹅、火鸡等的高致病性、接触传染性疾病。细菌脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组分之一，由类脂A，核心多糖和O-特异性多糖三部分组成。研究表明, LPS是革兰氏阴性菌的一种重要毒力因子。目前国内外对于RA LPS的分子结构以及致病机制研究仍为空白。内容：1：RA菌株CH3 LPS的分离纯化和单克隆抗体（McAb）制备；2：RA CH3和Yb2株基因组测序和提交GenBank；3：RA CH3 LPS合成相关基因鉴定及其生物学特性；4：RA Yb2株毒力基因鉴定及其功能分析。结果：1、运用Roche GS FLX和IlluminaMiseq测序平台分别对RA CH3和Yb2菌株进行基因组序列测定，并提交GenBank（CH3：Accession no. CP006649；Yb2：Accession no. CP007204）；2、RA CH3株 LPS分离纯化和McAb制备：培养细菌，离心收集后以酚水法抽提LPS。制备LPS特异性McAb 2株，均与RA 1型菌株特异性反应，而不与RA 2型和10型菌株反应；3、RA CH3株 LPS合成相关基因鉴定：用RA LPS McAb鉴定获得LPS相关基因5个,分别为M949_1360、M949_1603、M949_1556、M949_RS01915和M949_RS01035。其中突变株RA-M1（突变基因为M949_1603）缺失LPS的部分O抗原、毒力显著下降、对血清杀菌更敏感。其油乳剂灭活疫苗二次免疫后可对血清1型（WJ4）、血清2型（Yb2）和血清10型（HXb2）强毒攻击产生100%、70%、100%的免疫保护率；4、RA 毒力基因的鉴定：构建RA血清2型强毒Yb2株随机突变库，基因组范围内筛选获得49个毒力相关基因。鉴定1个LPS合成相关基因（AS87_04050基因）、1个调控相关基因（AS87_03730基因）和1个烟酰胺酶合成基因（AS87_01735基因）。关键数据：1、发表研究论文15篇,其中SCI收录论文10篇；2、培养硕士6名、博士1名；培育中国农科院优秀硕士学位论文1篇；3、获得一株具有交叉保护性LPS缺失疫苗候选株，对血清1型、2型和10型RA强毒的保护力达100%、70%和100%,可用于制备广谱疫苗。